大腸上皮幹細胞の単離・培養技術と、これを用いた大腸上皮移植技術

• 特願2011-236469 (2011.10.27) JP

• 渡辺 守
• 中村 哲也

• 国立大学法人　東京医科歯科大学

消化管疾患の治療における成体幹細胞の治療応用の可能性に対する関心が高まっている。胃、小腸及び大腸における上皮細胞の自己複製能及び生成能を有する消化管上皮幹細胞は、消化管の各部で組織恒常性の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献１～３）。最近の研究により、消化管幹細胞の生物学に関する知見が大幅に増加している。Ｗｎｔ、ＢＭＰ及びＮｏｔｃｈカスケードを含むいくつかのシグナル伝達経路が共に作用して、幹細胞の維持を調節し、上皮恒常性を制御することが示されている（非特許文献４）。系統追跡を用いる研究により、Ｗｎｔ標的遺伝子であるＬｇｒ５が、小腸及び大腸の陰窩（非特許文献５）の底部並びに胃ユニット（非特許文献６）の底部における幹細胞のマーカーとして同定された。

現在、確実なマーカーによって消化管幹細胞が認識できることから、消化管幹細胞を用いる細胞療法が多くの難治性疾患の治療を根本的に変えることが期待されつつある。しかし今日に至るまで、単離された消化管上皮細胞をインビトロで培養し増やした後に、傷害組織を修復する細胞療法の材料として用いた報告は全くない。また、培養し増殖させた消化管上皮幹細胞が傷害部位で組織を修復できるかどうかは未だ判明していない。上皮成分及び間葉成分を有する腸の小断片を長期にわたり培養できるようになったのは最近のことである（非特許文献７）。

非特許文献８には、単離した大腸陰窩をマトリゲル内に包埋し、完全陰窩培地を添加して、大腸上皮幹細胞を培養する方法が記載されている。かかる完全陰窩培地は、基本培地であるAdvanced DMEM/F12に、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔ３ａ馴化培地、ＥＧＦ、Ｎｏｇｇｉｎ、ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１、Ｂ－２７（登録商標）supplement（Invitrogen社製）、ガストリン、ニコチンアミド、Ａ８３－０１（ＴＧＦ－β １型受容体キナーゼ阻害剤）、及び、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８阻害剤）などを添加した培地である。Ｂ－２７（登録商標）supplementの厳密な組成は開示されていないが、ビオチン、Ｌ－カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）ガラクトース、還元型グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン、レチニル酢酸、セレン、トリオド－ｌ－チロミン、ビタミンＥ、ビタミンＥ酢酸塩、ウシアルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、トランスフェリンなどを含むことが知られている（非特許文献９）。大腸上皮幹細胞を無血清培地にてインビトロで培養する場合、ガストリン、ニコチンアミド、Ａ８３－０１（ＴＧＦ－β １型受容体キナーゼ阻害剤）、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８阻害剤）、及び、Ｂ－２７ supplementは必須な成分であると考えられており、中でも、Ｂ－２７ supplementは特に必要不可欠であると考えられていた。

ところで、ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin；ＢＳＡ）は、ウシの血清に多く含まれるアルブミンであり、脂肪酸や微量元素などの運搬体として機能することが知られている。Ｗｎｔ３ａは、ＷＮＴ３Ａ遺伝子によりコードされるタンパク質であり、β－カテニン経路を活性化することが知られている。Ｗｎｔ／β－カテニン経路は、幹細胞の増殖や、未分化性維持に関連していることが知られている。Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１（Roof-plate-specific Spondin-1；Ｒｓｐｏ１）は、ＲＳＰＯ１遺伝子によりコードされるタンパク質であり、背側神経管の分化に寄与し、腸陰窩上皮細胞の増殖を促進することが知られている。上皮細胞増殖因子（Epidermal Growth Factor；ＥＧＦ）は、ＥＧＦ遺伝子によりコードされるタンパク質であり、上皮細胞の増殖を促進することが知られている。肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor；ＨＧＦ）は、ＨＧＦ遺伝子によりコードされるタンパク質であり、肝細胞を始めとして、各種細胞の増殖を促進することが知られている。Ｎｏｇｇｉｎは、ＮＯＧ遺伝子によりコードされるタンパク質であり、形質転換増殖因子β（Transforming growth factor beta；ＴＧＦ－β）のシグナル伝達を阻害することが知られている。

しかし、基本培地成分（糖類などの炭素源、アミノ酸などの窒素源、無機塩）に加えて、血清アルブミン、Ｗｎｔ３ａ、及び、ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１を用いれば、無血清培地による培養であっても、マウスやヒトなどの哺乳動物の大腸組織から単離した大腸上皮幹細胞等をインビトロで長期間維持、増幅し得ることは全く知られていなかった。

本発明は、大腸上皮幹細胞及び／又は大腸上皮細胞（以下、「大腸上皮幹細胞等」とも省略する。）のインビトロ培養用培地や、かかる培地を用いて大腸上皮幹細胞等をインビトロで培養する方法や、かかる方法で培養して得られる大腸上皮幹細胞等を含有する、腸疾患の予防・治療剤や、大腸上皮幹細胞等の単離方法に関する。

• C12N   5/074     成体幹細胞
• C12N   5/071     脊椎動物細胞または組織，例．ヒト細胞または組織
• C12N  15/09      組換えＤＮＡ技術

• 4B024AA11 分析、診断
• 4B024CA04 ｃＤＮＡ
• 4B024CA09 プローブ
• 4B024CA11 ＲＮＡ
• 4B024HA12 ＤＮＡプローブを用いるもの
• 4B065AA91 ネズミ由来（マウス、ラット）
• 4B065AC20 その他
• 4B065BB02 無機化合物
• 4B065BB19 ペプチド，蛋白質
• 4B065BB32 無血清培地
• 4B065BD01 菌体の破砕，粉末化
• 4B065BD14 分離，精製
• 4B065BD45 プロテアーゼ
• 4B065CA44 医薬（ヒト用）；医療
• 4C087AA01 クレームが医薬用途発明又は医薬製法発明
• 4C087AA02 医薬用途，薬理作用機作の試験データがある
• 4C087AA03 物質の製造方法自体に特徴のあるもの
• 4C087BB50 胃，腸（１２指、小、大、盲、結直）
• 4C087BB64 培養細胞，培養組識
• 4C087NA14 新薬効の発現
• 4C087ZA66 消化器官用薬
• 4C087ZA68 消化性潰瘍用剤