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(In Japanese)キメラ2重鎖核酸

Patent code P150012549
File No. (S2012-0215-N0)
Posted date Nov 19, 2015
Application number P2014-528740
Publication number of japanese translations of PCT international publication for patent applications P2015-502134A
Patent number P6112569
Date of filing Dec 17, 2012
Date of national publication of the translated version (of PCT application) Jan 22, 2015
Date of registration Mar 24, 2017
International application number JP2012083180
International publication number WO2013089283
Date of international filing Dec 17, 2012
Date of international publication Jun 20, 2013
Priority data
  • P2011-275488 (Dec 16, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)横田 隆徳
  • (In Japanese)仁科 一隆
  • (In Japanese)小比賀 聡
  • (In Japanese)水澤 英洋
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京医科歯科大学
  • (In Japanese)国立大学法人大阪大学
Title (In Japanese)キメラ2重鎖核酸
Abstract (In Japanese)標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する二重鎖核酸複合体、並びにそれを利用する方法を開示する。
細胞内の転写産物レベルを低減する、1の方法であって、
該細胞と組成物とを接触させる工程を含み、
該組成物は、第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を含み、
第1の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、
(ii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズする
核酸鎖であり、かつ、
第2の核酸鎖は、ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖である、方法。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さや低毒性の観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のmRNA(センス鎖)の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO))を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。

図1(上部)に示す通り、ASOとしてRNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、標的遺伝子の転写産物(mRNA)と当該ASOとが結合して、部分的に二本鎖が形成される。そして、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。

一方、ASOとしてDNAからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、部分的にDNA-RNAのヘテロオリゴヌクレオチドが形成される。そして、RNaseHによってこの部分が認識され、標的遺伝子のmRNAが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害される(図1、下部)。また、ASOとしてDNAを用いた方(RNaseH依存的経路)がRNAを用いるよりも、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。

オリゴヌクレオチドを核酸医薬として利用する際には、標的RNAへの結合親和性の向上や生体内での安定性等を考慮し、ロックド核酸(Locked Nucleic Acid(LNA)(登録商標))等の様々な修飾核酸等が開発されている。

図2に示す通り、天然核酸(RNAやDNA)の糖部分は4つの炭素原子と1つの酸素原子とからなる5員環を有し、その糖部分はN型とS型の2種類のコンホメーションを取る。これらコンホメーションは互いに揺らいでおり、これにより核酸のらせん構造もA型とB型の異なった型をとることが知られている。前述のASOの標的となるmRNAは主に糖鎖がN型でA型のらせん構造をとっているため、RNAに対する親和性を高めるという観点から、ASOの糖鎖もN型をとることが重要になる。このコンセプトのもとに開発されたのがLNA(2’-O,4’-C-メチレン-架橋化核酸(2’,4’-BNA))等の修飾核酸である。例えば、LNAにおいては、2’位の酸素と4’位の炭素とをメチレン基によって架橋することにより、そのコンホメーションはN型に固定され、コンホメーション間のゆらぎは生じない。そのため、LNAを数ユニット組み込んで合成されたオリゴヌクレオチドは、従来の天然の核酸で合成されたオリゴヌクレオチドに比べて、RNAに対する結合力や配列特異性が極めて高く、かつ、優れた耐熱性とヌクレアーゼ耐性とを示す(特許文献1 参照)。他の人工核酸もかかる特性を有していることから、アンチセンス法の利用等において、人工核酸は強く注目されている(特許文献1~7 参照)。

また、オリゴヌクレオチドを医薬に適用する際には、当該オリゴヌクレオチドを標的部位に特異性高く効率良く送達できることが重要である。そして、オリゴヌクレオチドの送達方法として、コレステロールやビタミンE等の脂質を利用する方法(非特許文献1及び2)や、RVG-9R等の受容体特異的ペプチドを利用する方法(非特許文献3)や、標的部位に特異的な抗体を利用する方法(非特許文献4)が開発されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制する活性を有する二重鎖核酸に関し、より詳しくは、4塩基以上の連続した核酸を含む領域を含む、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸とを含む二重鎖核酸に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞内の転写産物レベルを低減するための医薬組成物であって、
該医薬組成物は、第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含む二本鎖核酸複合体を含み、
(i)第1の核酸鎖は、
前記転写産物にハイブリダイズし、そして
(a)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドを含み、さらに(b)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む5’ウイング領域、ならびに/または
(c)前記RNaseHにより認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドもしくは修飾DNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数のヌクレオチドアナログもしくは修飾ヌクレオチドアナログを含む3’ウイング領域を含む核酸鎖であり、そして
(d)第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及びヌクレオチドアナログの総数が、12~25ヌクレオチドであり、かつ、
(ii)第2の核酸鎖は、
(a)少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドと、さらに
(b)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの5’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログ、ならびに/または
(c)前記少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドの3’末側に配置された1又は複数の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよび/もしくは修飾ヌクレオチドアナログとを含む核酸鎖であり、そして
(d)第2の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項2】
 
第2の核酸鎖は、
(i)RNAヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にDNAヌクレオチドとを含み、
(ii)DNAヌクレオチド及び/又はヌクレオチドアナログを含み、又は、
(iii)PNAヌクレオチドを含む
核酸鎖である、請求項1に記載の医薬組成物。

【請求項3】
 
前記転写産物は、タンパク質をコードするmRNA転写産物である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。

【請求項4】
 
前記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが同じである医薬組成物。

【請求項6】
 
請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数と、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの総数とが異なる、医薬組成物。

【請求項7】
 
請求項6に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖におけるRNAヌクレオチド、DNAヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ及びPNAヌクレオチドの前記総数が、第1の核酸鎖におけるヌクレオチド及び任意に含まれるヌクレオチドアナログの前記総数よりも大きい、医薬組成物。

【請求項8】
 
請求項1~7のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項9】
 
請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、
RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、RNaseHによって認識される前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項10】
 
請求項9に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、該3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項11】
 
請求項10に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。

【請求項12】
 
請求項11に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。

【請求項13】
 
請求項1~12のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、2’-O-CH3基又は2’-O-CH2CH2OCH3(MOE)基を含むヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項14】
 
請求項1~13のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、医薬組成物。

【請求項15】
 
請求項14に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項16】
 
請求項14に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、4’-(CH2)p-O-2’、4’-(CH2)p-S-2’、4’-(CH2)p-OCO-2’、4’-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。R3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。

【請求項17】
 
請求項1~16のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、医薬組成物。

【請求項18】
 
請求項1~17のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖における少なくとも1つのヌクレオチドアナログがホスホロチオエート化されている、医薬組成物。

【請求項19】
 
請求項1~18のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第1の核酸鎖が、前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される4~20個の連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項20】
 
請求項919のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
第1の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)前記転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される前記連続したヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである、医薬組成物。

【請求項21】
 
請求項1~20のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される、少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項22】
 
請求項21に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’及び/又は3’側に、1又は複数のホスホロチオエート化されているヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項23】
 
請求項22に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの5’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる5’ウィング領域、及び/又は、
前記少なくとも4つの連続したヌクレオチドの3’側に位置する1又は複数のヌクレオチドアナログからなる3’ウィング領域を含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項24】
 
請求項23に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域を含み、該5’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含み、かつ、第1の核酸鎖における前記3’ウィング領域が少なくとも2つのヌクレオチドアナログを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項25】
 
請求項24に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~10個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。

【請求項26】
 
請求項25に記載の医薬組成物であって、前記5’ウィング領域及び前記3’ウィング領域が、独立して2~3個のヌクレオチドアナログを含む、医薬組成物。

【請求項27】
 
請求項2126のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、2’-O-CH3基又は2’-O-CH2CH2OCH3(MOE)基を含むRNAヌクレオチドを少なくとも1つ含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項28】
 
請求項2127のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログが架橋化ヌクレオチドである、医薬組成物。

【請求項29】
 
請求項28に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、LNA、cEt-BNA、アミドBNA(AmNA)及びcMOE-BNAから独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項30】
 
請求項28に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖が、4’-(CH2)p-O-2’、4’-(CH2)p-S-2’、4’-(CH2)p-OCO-2’、4’-(CH2)n-N(R3)-O-(CH2)m-2’によって、2’位の炭素と4’位の炭素とが架橋されているリボヌクレオチドから、独立して選択される架橋化ヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物(p、m及びnは、各々1~4、0~2及び1~3の整数である。R3は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は、細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドを示す)。

【請求項31】
 
請求項2330のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、
第2の核酸鎖が、前記5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、
(i)該5’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、(ii)該3’ウィング領域におけるヌクレオチドアナログは架橋化ヌクレオチドであり、かつ、
(iii)第2の核酸鎖が第1の核酸鎖にアニーリングした際に、RNaseHによって切断される前記連続したヌクレオチドは、RNAヌクレオチドである、医薬組成物。

【請求項32】
 
請求項31に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖において、少なくとも1つのRNAヌクレオチド及び又は少なくとも1つのヌクレオチドアナログが、ホスホロチオエート化されている、医薬組成物。

【請求項33】
 
請求項2~20のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖がPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項34】
 
請求項1~4及び6~28のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記二本鎖核酸複合体が、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む複合体である、医薬組成物。

【請求項35】
 
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は第1の核酸鎖と同じである、医薬組成物。

【請求項36】
 
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖は、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
(ii)第2の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したヌクレオチドを含み、
(iii)該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~100であり、かつ
(iv)第2の転写産物にハイブリダイズする
核酸である、医薬組成物。

【請求項37】
 
請求項34に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖はPNAヌクレオチドを含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項38】
 
請求項3437のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、第3の核酸鎖が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項39】
 
請求項1~41のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、医薬組成物。

【請求項40】
 
請求項39に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、前記核酸鎖の3’末端のヌクレオチド又は5’末端のヌクレオチドに結合している、医薬組成物。

【請求項41】
 
請求項39又は40に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が脂質である、医薬組成物。

【請求項42】
 
請求項41に記載の医薬組成物であって、前記脂質が、コレステロール、脂肪酸、脂溶性ビタミン、糖脂質及びグリセリドから選択される、医薬組成物。

【請求項43】
 
請求項41に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、コレステロール、トコフェロール及びトコトリエノールから選択される脂質である、医薬組成物。

【請求項44】
 
請求項39又は40に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分が、受容体のリガンド及び抗体から選択されるペプチド又はタンパク質である医薬組成物。

【請求項45】
 
医薬組成物であって、
(A)第2の核酸鎖がアニーリングしている第1の核酸鎖を含み、突出したヌクレオチドを有さない、二本鎖核酸複合体と、
(B)薬理学上許容される担体とを含み、
第1の核酸鎖が、
(i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、該核酸鎖における該ヌクレオチド及び任意に含まれる該ヌクレオチドアナログの総数は8~25であり、
(ii)遺伝子の転写産物にハイブリダイズした際に、RNaseHによって認識される少なくとも4つの連続したDNAヌクレオチドを含み、
(iii)架橋化ヌクレオチドからなる5’ウィング領域及び3’ウィング領域を含み、(iv)ホスホロチオエート化されているヌクレオチドを任意に含み、かつ、
(v)前記転写産物にハイブリダイズする核酸鎖であり、
第2の核酸鎖が、
i)ヌクレオチドと任意にヌクレオチドアナログとを含み、
ii)少なくとも4つの連続したRNAヌクレオチドを含み、かつ、
iii)ホスホロチオエート化されているヌクレオチドを任意に含む核酸鎖であ
さらに、第2の核酸鎖にアニーリングする第3の核酸鎖を更に含む、医薬組成物。

【請求項46】
 
請求項45に記載の医薬組成物であって、第2の核酸鎖及び第3の核酸鎖のうちの少なくとも1の核酸鎖が、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分を更に含む核酸鎖である、医薬組成物。

【請求項47】
 
請求項45又は46に記載の医薬組成物であって、前記機能性部分がビタミンE及びコレステロールから選択される、医薬組成物。

【請求項48】
 
請求項4547のうちのいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記架橋化ヌクレオチドがLNAである、医薬組成物。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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