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METHOD OF CONVERTING BASE IN NUCLEIC ACID, AND NUCLEOBASE CONVERTING AGENT

Patent code P150012613
File No. S2014-0789-N0
Posted date Nov 26, 2015
Application number P2014-073943
Publication number P2015-195736A
Patent number P6328466
Date of filing Mar 31, 2014
Date of publication of application Nov 9, 2015
Date of registration Apr 27, 2018
Inventor
  • (In Japanese)藤本 健造
  • (In Japanese)坂本 隆
  • (In Japanese)大江 美成子
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
Title METHOD OF CONVERTING BASE IN NUCLEIC ACID, AND NUCLEOBASE CONVERTING AGENT
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of performing single base substitution in nucleic acid.
SOLUTION: A method of converting a base includes: a process in which inosine, photoresponsive modified nucleic acid into which photoresponsive modified nucleoside is introduced, and a target nucleic acid which has a base sequence complementary with a photoresponsive modified nucleic acid and has cytosine (C) at a complementary position corresponding to inosine are hybridized to form a double strand; a process in which the formed double strand is irradiated with light to form photo cross-linking between the photoresponsive modified nucleic acid and the target nucleic acid; and a process in which the double strand to which the photo cross-linking was formed is incubated to perform base conversion to cytosine (C) in the target nucleic acid into uracil (U).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

分子生物学的の分野において、人為的な遺伝子の点突然変異(一塩基置換)、すなわち、意図した遺伝子の意図した位置で意図した一塩基置換を人為的に生じさせる技術は、長年の夢であり、永らく求められてきていた。

一方、核酸の光反応技術として、5-シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術(特許文献1:特許第3753938号、特許文献2:特許第3753942号)、3-ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術(特許文献3:特許第4814904号、特許文献4:特許第4940311号)がある。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、核酸中の塩基を変換する方法、及び核酸塩基変換剤に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
次の式I:
【化1】
 
(省略)
(ただし、式I中、
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
【化2】
 
(省略)
(ただし、式II中、R11は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、
を含む、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する方法。

【請求項2】
 
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程、の後に、さらに、
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程、
を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、20℃~40℃の範囲の温度でインキュベーションして行われる、請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
 
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、1時間~10日間の範囲でインキュベーションして行われる、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
光架橋が形成された二重鎖をインキュベーションして、標的核酸中のシトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換する工程が、
光架橋が形成された二重鎖を、pH6.2~7.8の範囲のpHでインキュベーションして行われる、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
 
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、340nm~380nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
 
形成された二重鎖に対して、光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒~30秒の範囲で光照射して行われる、請求項1~6のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
 
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、300nm~330nmの範囲の波長を含む光を、光照射して行われる、請求項2~7のいずれかに記載の方法。

【請求項9】
 
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程が、
形成された二重鎖に対して、0.1秒~30秒の範囲で光照射して行われる、請求項2~8のいずれかに記載の方法。

【請求項10】
 
光架橋が形成された二重鎖に対して、光照射して、光架橋を開裂させる工程の後に、さらに、
光架橋が開裂した二重鎖を解離して、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸の鎖を得る工程、
を含む、請求項2~9のいずれかに記載の方法。

【請求項11】
 
請求項1~10のいずれかに記載の方法によって、シトシン(C)をウラシル(U)へと塩基変換された標的核酸を製造する方法。

【請求項12】
 
次の式I:
【化3】
 
(省略)
(ただし、式I中、
R1は、水素を表し、
R2は、水酸基を表し、
R3は、水素又は水酸基である)
で表されるイノシンが、式IでR1に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入され、次の式II:
【化4】
 
(省略)
(ただし、式II中、R11は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される光応答性修飾ヌクレオシドが、塩基配列中において上記イノシンの3’側に隣接した位置に、式IIでR4に結合しているOと一体となって形成されたリン酸基によってリン酸ジエステル結合して導入された、光応答性修飾核酸。

【請求項13】
 
請求項12に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸塩基変換剤。

【請求項14】
 
請求項12に記載の光応答性修飾核酸と、
上記光応答性修飾核酸と相補的な塩基配列を有し、塩基配列中の上記イノシンに対応する相補的な位置に、核酸塩基としてシトシン(C)を有する、標的核酸とを、
ハイブリダイズして二重鎖を形成する工程、
形成された二重鎖に対して光照射して、光応答性修飾核酸と標的核酸の間に光架橋を形成する工程、
を含む、光架橋を形成する方法。

【請求項15】
 
請求項14に記載の方法によって、光架橋が形成された核酸を製造する方法。

【請求項16】
 
請求項12に記載の光応答性修飾核酸からなる、核酸光架橋剤。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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