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FORWARD PRIMER UPDATE_EN

Patent code P160012805
File No. S2014-0982-N0
Posted date Feb 24, 2016
Application number P2014-136929
Publication number P2016-013099A
Date of filing Jul 2, 2014
Date of publication of application Jan 28, 2016
Inventor
  • (In Japanese)中村 美紀子
  • (In Japanese)赤田 倫治
  • (In Japanese)星田 尚司
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title FORWARD PRIMER UPDATE_EN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a forward primer, with which a sequence having promoter activity can be linked to upstream of a target gene sequence by PCR, without requiring complicated operation such as restriction enzyme treatment and ligation and preparation of a DNA fragment comprising a promoter sequence.
SOLUTION: A forward primer for linking a sequence having promoter activity to upstream of a target gene sequence is prepared, the forward primer comprising a sequence which includes a base sequence represented by sequence number 1, has length of 30-150 bases and promoter activity.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

様々なタンパク質を細胞に発現させる技術は、細胞内におけるタンパク質の機能解析や有用タンパク質の生産などにおいて広く用いられており、今日では欠かせない技術である。細胞内で目的遺伝子などを発現させるには、プロモータ配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAを作製し、かかるDNAコンストラクトを細胞に導入する方法が一般的である。この方法を用いる場合には、プロモータ配列を目的遺伝子配列の上流に連結する必要がある。

現在、DNAを連結するために最も一般的に用いられている方法は、DNAリガーゼを用いて、平滑末端を有するDNA分子同士又は相補的な突出末端を有するDNA分子同士を結合させるものである。しかし、かかる方法は、制限酵素処理とDNAリガーゼによるDNAの連結という複雑なin vitro操作を必要としていた。

特許文献1には、目的遺伝子配列、発現マーカー配列及びポリアデニレーションシグナル配列から構成されるDNA断片をPCRにより作製する方法が提案されている。この特許文献1記載の方法を用いれば、プロモータ配列の下流に目的遺伝子配列を連結することが可能となるが、プロモータ配列の3’末端及び目的遺伝子配列の5’末端に制限酵素サイト或いはアニーリング配列をそれぞれ組み込む必要があった。

また、特許文献2には、特定のターミネータ配列を含む(ターミネータ能力を有する)高発現用リバースプライマーを用いて、プロモータ配列、目的遺伝子配列、特定のターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖DNAをPCRにより作製する方法が提案されている。この特許文献2の方法を用いれば、制限酵素処理やライゲーションをすることなく、ターミネータ能力を有するリバースプライマーを用いることによって、ターミネータ能力を有する配列を目的遺伝子配列の下流に連結することが可能となるが、あくまで、ターミネータ能力を有する配列を目的遺伝子配列の下流に連結する方法であり、プロモータ活性を有する配列と目的遺伝子配列とをPCRのみで連結する方法の開発には至っていなかった。

さらに、特許文献3には、2種類の標的DNA断片を融合させるために用いられる1組のプライマーを用いてオーバーラップエクステンションPCRを行うことにより、複数のDNA断片を融合させる方法が提案されている。この特許文献3の方法を用いれば、複数のDNA断片をPCRのみによって融合することが可能であるが、かかる方法に用いるプライマーはDNA断片を融合するためのプライマーであって、プロモータ配列を融合するためのものではなく、また、プロモータ活性を有するものでもなく、プロモータ配列を連結するにはプロモータ配列を含むDNA断片を調製する必要があった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖DNAを作製するためのフォワードプライマーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
プロモータ活性を有する配列を目的遺伝子配列の上流に連結するためのフォワードプライマーであって、配列番号1に示される塩基配列を含む長さ30~150塩基からなるプロモータ活性を有する配列を備えたフォワードプライマー。

【請求項2】
 
プロモータ活性を有する配列が、シミアンウイルス40由来の配列であることを特徴とする請求項1記載のフォワードプライマー。

【請求項3】
 
プロモータ活性を有する配列が、以下の(a)~(c)のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項1記載のフォワードプライマー。
(a)配列番号2~9のいずれかに示される塩基配列;
(b)配列番号2~9のいずれかに示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列;
(c)配列番号2~9いずれかに示される塩基配列との同一性が90%以上の塩基配列;

【請求項4】
 
プロモータ活性を有する配列が目的遺伝子配列の上流に連結した線状二本鎖DNAであって、前記プロモータ活性を有する配列が、配列番号1に示される塩基配列を含む長さが30~150塩基からなるプロモータ活性を有する配列であることを特徴とする線状二本鎖DNA。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published


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