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METHOD OF QUICKLY ANALYZING THE GENE OF FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA AND PRIMER SET USED FOR THE METHOD

Patent code P160012808
File No. P10-057
Posted date Feb 25, 2016
Application number P2012-132894
Publication number P2013-017478A
Patent number P6099120
Date of filing Jun 12, 2012
Date of publication of application Jan 31, 2013
Date of registration Mar 3, 2017
Priority data
  • P2011-131710 (Jun 13, 2011) JP
Inventor
  • (In Japanese)馬渕 宏
  • (In Japanese)野原 淳
  • (In Japanese)野口 徹
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人金沢大学
Title METHOD OF QUICKLY ANALYZING THE GENE OF FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA AND PRIMER SET USED FOR THE METHOD
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of quickly, efficiently and comprehensively detecting the genetic mutation related to FH, especially the genetic mutation of all the exons of, especially, LDLR.
SOLUTION: There is provided a primer set, which can detect the presence or absence of genetic mutation related to FH, all the exons of, especially, LDLR genes, the genetic mutation in the boundary region between exons and introns, or genetic polymorphism at a time.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

(家族性高コレステロール血症)
血中総コレステロール(total cholesterol; TC)のうち、低比重リポタンパクコレステロール(low-density lipoprotein cholesterol; LDL-C)は動脈硬化を促進し、高比重リポタンパクコレステロール(high-density lipoprotein cholesterol; HDL-C)は動脈硬化を抑制する。FHは、遺伝的に顕著な高LDL-C血症を示す。
従来、FHは稀な疾患と考えられていたが、実は最も頻度の高い遺伝性疾患の一つであり、適切な診断と病態の理解と治療は日常診療でもきわめて重要である。

FHの臨床症状の三つの主な特徴は高LDL-C血症、腱黄色腫、冠動脈疾患(coronary heart disease; CHD)である。FHは常染色体優性遺伝性疾患であり、ヘテロ接合体性FH(以下、ヘテロFHと称する場合がある)とホモ接合体性FH(以下、ホモFHと称する場合がある)が区別できる。

(高LDL-C血症)
本発明者らの調査では、ヘテロFHの血中TC(平均±SD)は330±60 mg/dl、ホモFHでは669±104 mg/dl、正常者では179±26 mg/dlである。よって、ホモFH及びヘテロFHは、正常者と比較して、それぞれ約2倍及び約4倍となっている。

(腱黄色腫)
腱黄色腫はFHに特異的な臨床症状であり、その好発部位は手背伸筋腱、アキレス腱などである。
アキレス腱のX線撮影はアキレス腱黄色腫を客観的・定量的に評価する方法である。アキレス腱厚は、正常者では6.3±1.2 mm(平均±SD)であり、9.0 mm以上はアキレス腱黄色腫と診断できる。アキレス腱肥厚はFHの85%で確認できる。アキレス腱黄色腫が認められないFH、特に若年者FHの診断には家族調査や遺伝子診断が必須である。
FHに皮膚黄色腫が出現する頻度は必ずしも高くない。特に高コレステロール血症が軽症の若年ヘテロFH患者ではほとんど黄色腫はみられない。10歳未満で黄色腫を認められる例はホモFHと考えられる。黄色腫を指標にFHをスクリーニングすると見逃す可能性が非常に高い。特に全身性黄色腫はホモFHであるか、極めて重症のヘテロFHしか認められない。
よって、腱黄色腫のみをFHの診断の指標とすることは非常に危険である。

(冠動脈硬化症)
FHは高頻度に動脈硬化症、特に冠動脈硬化症、大動脈硬化症を併発する。FHにおける末梢動脈硬化は稀である。

(FHの成因)
細胞内コレステロールは細胞膜の構成成分として、また、性ホルモン及び胆汁酸の前駆物質として重要であり、欠乏や過剰が起こらないように制御されている。細胞内コレステロールが過剰になればコレステロール合成酵素(HMG-CoA還元酵素)が抑制され、血中からLDL-Cを取り込むLDLRが減少する。細胞内コレステロールが減少すればHMG-CoA還元酵素活性が増加し、LDLRが増加して血中LDL-Cを細胞内へ取り込む。このことから、LDL-Cが細胞に入る機構の異常がFHの原因と考えられる。
なおLDLRは細胞表面にある糖タンパク質であり、LDLR遺伝子は第19染色体短腕上にあり、その大きさは約45kbで、18のエクソンと17のイントロンから成る。該遺伝子のどこかにLDLRの機能異常を来たす変異があれば、FHが発症する。

上記以外の原因によるFHとして、LDLRのリガンドであるアポリポ蛋白B(ApoB)の異常による家族性欠陥アポリポ蛋白B血症(familial defective apolipoprotein B-100; FDB)、proprotein convertase subtilisin/kexin type 9(PCSK9)機能亢進症、常染色体性劣性遺伝性高コレステロール血症(autosomal recessive hypercholesterolemia; ARH)が知られている。

また、LDLR遺伝子の変異については、下記文献に一部記載されている。
特許文献1では、「ヒトLDLレセプター遺伝子のエクソン4のコドン109の塩基配列がTCAになっているか又はこれにCが挿入されてTCCAになっているかを調べることから成る、ヒトLDLレセプター遺伝子異常の診断方法」を開示している。
特許文献2では、「195個の候補遺伝子に関し258個の遺伝子多型をPCR、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ、およびサスペンション・アレイ・テクノロジー(SAT)を用いて検出し、脂質代謝異常に有意に関連する遺伝子多型を検出する方法」を開示している。
特許文献3では、「家族性高コレステロール血症を引き起こす突然変異の存在の有無を分析する体外法」を開示している。
上記特許文献では、LDLR遺伝子の変異が単に列挙されているのみである。千以上の存在が知られているLDLR遺伝子の変異をどのように検出すれば、効率的にFH関連遺伝子変異を特定できるかが不明である。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、迅速かつ効率的に家族性高コレステロール血症(familial hypercholesterolemia; FH)に関連する遺伝子変異、特に低比重リポタンパク質受容体(low-density lipoprotein receptor; LDLR)遺伝子の全エクソンの遺伝子変異を迅速かつ網羅的に検出する方法、および遺伝子多型(single nucleotide polymorphism; SNP)を同時に検出して除外する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の各プライマーセット(1)~(16)が複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されており、試料を各ウェル内でポリメラーゼ連鎖反応を行うことによりLDLR2~17の遺伝子変異を同時に検出することができる家族性高コレステロール血症(FH)の存在を検出するためのキット。
(1)それぞれ配列番号3及び配列番号4で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット2
(2)それぞれ配列番号67及び配列番号68で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット3C
(3)それぞれ配列番号69及び配列番号70で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット4F
(4)それぞれ配列番号71及び配列番号72で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット5C
(5)それぞれ配列番号13及び配列番号14で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット6
(6)それぞれ配列番号15及び配列番号73で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット7B
(7)それぞれ配列番号75及び配列番号76で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット8D
(8)それぞれ配列番号19及び配列番号20で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット9A
(9)それぞれ配列番号21及び配列番号22で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット10A
(10)それぞれ配列番号23及び配列番号24で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット11A
(11)それぞれ配列番号25及び配列番号26で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット12A
(12)それぞれ配列番号27及び配列番号28で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット13A
(13)それぞれ配列番号29及び配列番号30で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット14A
(14)それぞれ配列番号31及び配列番号32で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット15
(15)それぞれ配列番号33及び配列番号34で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット16
(16)それぞれ配列番号35及び配列番号36で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット17

【請求項2】
 
さらに、以下のプライマーセットが複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されており、さらに、intron 7のc.1060+10G>C、 exon 9のc.1194C>T、exon 10のc.1413A>G、exon 11のc.1617C>T、exon 12のc.1773C>T及びexon 13のc.1959T>Cを同時に検出することができる請求項1に記載のキット。
(1)それぞれ配列番号74及び配列番号73で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット7C
(2)それぞれ配列番号77及び配列番号78で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット9B
(3)それぞれ配列番号79及び配列番号80で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット10D
(4)それぞれ配列番号81及び配列番号82で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット11B
(5)それぞれ配列番号83及び配列番号84で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット12D
(6)それぞれ配列番号85及び配列番号86で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット13B

【請求項3】
 
さらに、以下のプライマーセットが複数の領域に区画された容器に添加されており、さらに、apoBの遺伝子変異を同時に検出することができる請求項1又は2に記載のキット。(1)それぞれ配列番号39及び配列番号40で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット19

【請求項4】
 
以下の工程1、2を含む、LDLR2~17の遺伝子変異を同時に検出することができる家族性高コレステロール血症(FH)の変異を検出する方法
工程1.試料を、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加する工程、ここで、該ウェルには、以下の各プライマーセット(1)~(16)が複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されており、
(1)それぞれ配列番号3及び配列番号4で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット2
(2)それぞれ配列番号67及び配列番号68で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット3C
(3)それぞれ配列番号69及び配列番号70で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット4F
(4)それぞれ配列番号71及び配列番号72で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット5C
(5)それぞれ配列番号13及び配列番号14で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット6
(6)それぞれ配列番号15及び配列番号73で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット7B
(7)それぞれ配列番号75及び配列番号76で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット8D
(8)それぞれ配列番号19及び配列番号20で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット9A
(9)それぞれ配列番号21及び配列番号22で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット10A
(10)それぞれ配列番号23及び配列番号24で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット11A
(11)それぞれ配列番号25及び配列番号26で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット12A
(12)それぞれ配列番号27及び配列番号28で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット13A
(13)それぞれ配列番号29及び配列番号30で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット14A
(14)それぞれ配列番号31及び配列番号32で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット15
(15)それぞれ配列番号33及び配列番号34で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット16
(16)それぞれ配列番号35及び配列番号36で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット17、及び
工程2.該試料を各ウェル内でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程。

【請求項5】
 
さらに、以下のプライマーセットが複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されており、さらに、intron 7のc.1060+10G>C、exon 9のc.1194C>T、exon 10のc.1413A>G、exon 11のc.1617C>T、exon 12のc.1773C>T及びexon 13のc.1959T>Cを同時に検出することができる請求項4に記載の検出する方法。
(1)それぞれ配列番号74及び配列番号73で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット7C
(2)それぞれ配列番号77及び配列番号78で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット9B
(3)それぞれ配列番号79及び配列番号80で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット10D
(4)それぞれ配列番号81及び配列番号82で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット11B
(5)それぞれ配列番号83及び配列番号84で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット12D
(6)それぞれ配列番号85及び配列番号86で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット13B

【請求項6】
 
さらに、以下のプライマーセットが複数の領域に区画された容器に添加されており、さらに、apoBの遺伝子変異を同時に検出することができる請求項4又は5に記載の検出する方法。
(1)それぞれ配列番号39及び配列番号40で表される塩基配列を含む2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット19

【請求項7】
 
前記検出方法が、HRM(High Resolution Melting)法である請求項4~6のいずれか1に記載の検出する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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