Top > Search of Japanese Patents > NOVEL VECTOR AND METHOD FOR PRODUCING SOLUBILIZED PROTEIN USING THE SAME

NOVEL VECTOR AND METHOD FOR PRODUCING SOLUBILIZED PROTEIN USING THE SAME commons

Patent code P160012865
File No. N15061
Posted date Mar 17, 2016
Application number P2015-226253
Publication number P2017-093313A
Date of filing Nov 19, 2015
Date of publication of application Jun 1, 2017
Inventor
  • (In Japanese)野村 隆臣
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人信州大学
Title NOVEL VECTOR AND METHOD FOR PRODUCING SOLUBILIZED PROTEIN USING THE SAME commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a novel vector and method for producing a solubilized protein using the vector to overcome disadvantages of a conventional expression system in E. coli, the system using an expression vector widely as a protein synthesis system based on genetic information, but the vector being often insoluble and inactivated, especially when a eukaryotic protein is expressed.
SOLUTION: According to the present invention, a method for producing a soluble protein using a transformant being transformed by a vector is provided. The vector is an E. coli transformation vector in which an expression induction system of L11 gene introduced. The vector comprises a promoter capable of regulating the expression of the L11-expressing gene by an inducer, the promoter being incorporated upstream of the L11-expressing gene. Here, a promoter that can be regulated by an inducer different from the inducer of the L11 gene expression induction system may be introduced into the system for inducing expression of a target protein gene.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ゲノム解析技術の進歩により、多種多様な生物のゲノム情報が蓄積され、それとともに、膨大な機能未知遺伝子の存在が明らかにされている。機能未知遺伝子の機能解析はポストゲノム解析の最重要課題であるが、その進展はゲノム解析と比較して遅れている。この最大の理由は、機能未知遺伝子がコードするタンパク質を、機能を保持した可溶性の状態で合成できないことがあるためである。

遺伝子情報を元にしてタンパク質を合成する方法として、対象とする遺伝子を導入した発現ベクターを用いて、大腸菌内でタンパク質を合成させる方法が知られている(非特許文献1)。この方法は、実験操作の容易さ、低コスト、高収量であることから、最も広く使用されているが、対象としたタンパク質が、不活性な不溶性の凝集体(封入体)として合成されることがある(非特許文献1)。これは、真核生物由来のタンパク質で多く見られる傾向にあり、原因の一つとして、大腸菌のタンパク質合成が、真核生物と比較して過度に速く、合成されるタンパク質の量も多いため、タンパク質の機能化に必要な高次構造の折り畳みが正常に行われていないことが挙げられる。

一方、低温培養した大腸菌内では、発現ベクターに導入された遺伝子情報をもとに合成されるタンパク質が、機能を保持した可溶性の状態で生成されることが知られており、これは、低温環境下にすることで、大腸菌内のタンパク質合成の速度が低下したことに起因すると考えられている(非特許文献2)。このことを受けて、ターゲットタンパク質の発現宿主の大腸菌を12から25℃の低温条件で培養することにより、合成されたタンパク質が封入体にはならず、可溶性の状態で得られる技術が報告されている(特許文献1)。

細胞内におけるタンパク質合成は、細胞内小顆粒のリボソームが、遺伝子情報に従って、アミノ酸を重合することで行われる。この反応は、GTP結合型翻訳因子(GTPase翻訳因子)が、リボソームのGTPaseセンターと呼ばれる特定の領域で相互作用し、その際に生じるGTP加水分解エネルギーによって促進されることが知られている。

GTPaseセンターは、リボソーム中でも特にタンパク質に富んだ領域であり、大腸菌リボソームのGTPaseセンター構成タンパク質の一つであるL11は、GTPase翻訳因子との相互作用に関連することが知られており、L11を欠損した大腸菌変異株(例えば、AM68株)は、生育が野生株よりも遅く、AM68株から単離したリボソームは、タンパク質合成速度が低下していることが知られている(非特許文献3及び4)。これを受けて、AM68株を発現宿主とすることで、真核生物に由来するタンパク質を可溶化状態で合成する技術が報告されている(特許文献2)

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、可溶化タンパク質の製造方法に関する。具体的には、新規な発現ベクターを用いて、目的とする可溶化タンパク質の効率的な製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
L11発現遺伝子の上流に、L11発現遺伝子の発現を誘導物質により調節できる誘導性プロモーターを組み込んだL11遺伝子の発現誘導システムが導入された大腸菌形質転換用ベクターであって、当該L11遺伝子の発現誘導システムの誘導物質とは異なる誘導物質により調節できる誘導性プロモーターをターゲットタンパク質発現遺伝子の上流に組み込んだターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムが導入されていてもよいベクター。

【請求項2】
 
前記L11遺伝子の発現誘導システムとターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムとが導入されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。

【請求項3】
 
前記L11遺伝子の発現誘導システムおよびターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムに導入される誘導性プロモーターが、互いに異なり、araBADプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、trpプロモーター、λプロモーターpLおよびphoAプロモーターの群の中から選択される1種である事を特徴とする、請求項1または2に記載のベクター。

【請求項4】
 
前記L11遺伝子の発現誘導システムに導入される誘導性プロモーターが、araBADプロモーターであり、ターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムに導入される誘導性プロモーターが、tacプロモーターである事を特徴とする、請求項3に記載のベクター。

【請求項5】
 
配列表の配列番号1に示される塩基配列またはその配列の1もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列で示される塩基配列を有することを特徴とする、請求項4に記載のベクター。

【請求項6】
 
請求項1~請求項5のいずれかに記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする、可溶化タンパク質製造用形質転換体。

【請求項7】
 
請求項6に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、可溶化した真核生物由来タンパク質の製造方法。

【請求項8】
 
L11遺伝子の発現誘導システムの誘導性プロモーターがaraBADプロモーターで、誘導物質がアラビノース(arabinose)であり、ターゲットタンパク質遺伝子の発現誘導システムの誘導性プロモーターがtacプロモーターで、誘導物質がイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)である事を特徴とする、請求項7に記載の可溶化した真核生物由来タンパク質の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

※Click image to enlarge.

JP2015226253thum.jpg
State of application right Published
Please contact us by E-mail or facsimile if you have any interests on this patent.


PAGE TOP

close
close
close
close
close
close
close