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HIGH SENSITIVITY BIOSENSING SYSTEM OF INJURIOUS MICROORGANISM USING PROBE-MODIFIED NANO PARTICLE meetings

Patent code P160012921
File No. FU534
Posted date Apr 19, 2016
Application number P2013-108792
Publication number P2014-226093A
Patent number P6198040
Date of filing May 23, 2013
Date of publication of application Dec 8, 2014
Date of registration Sep 1, 2017
Inventor
  • (In Japanese)末 信一朗
  • (In Japanese)里村 武範
  • (In Japanese)坂元 博昭
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人福井大学
Title HIGH SENSITIVITY BIOSENSING SYSTEM OF INJURIOUS MICROORGANISM USING PROBE-MODIFIED NANO PARTICLE meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a high sensitivity biosensing technology of injurious microorganisms which works rapidly and simply as compared with a conventional method.
SOLUTION: A first particle loaded with a first probe on its surface and having magnetism, and a second particle consisting of a metal nano particle loaded with a second probe and an electrochemical active substance on its surface are used to form a complex in which the first particle and the second particle are linked through DNA of a target microorganism by hybridizing the DNA to the two probes. The electrochemical active substance is detected by collecting complexes using a magnetic interaction and by subjecting the collected complexes to an electrochemistry measurement.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

有害微生物による食中毒や感染症は深刻な社会問題となっている。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)による院内感染が依然として発生している他に、カンピロバクターやサルモネラ属菌による問題がある。そのため、適切な防疫処置を実施するための有害微生物の迅速な検出手段が求められている。

従来の有害微生物に対する検出方法には、培養法、免疫学的手法、遺伝子工学的手法(リアルタイムPCR法等)等がある。いずれの方法も感度は高いものの、長期間の培養や煩雑な操作を必要とするため、迅速な検知は不可能であった。また、リアルタイムPCR法ではコストが高いという問題がある。さらに、検出には大型の装置が必要であるため、携帯性に乏しく「その場」分析も困難である。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、衛生検査のための有害微生物の検出技術に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
検査試料中の標的微生物を検出するための方法であって、
(1)検査試料からDNAを抽出し、かつ抽出したDNAを一本鎖DNAに解離させる工程、
(2)得られた一本鎖DNAと、標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよびフェロセンが表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子とを、該一本鎖DNA中にある第1の領域と第1のプローブとの間、および、該一本鎖DNA中にある第2の領域と第2のプローブとの間のハイブリダイゼーションを許容する条件下において接触させ、それにより該一本鎖DNAを介して第1の粒子と第2の粒子とが連結された複合体を形成させる工程、
(3)磁気的相互作用を介して該複合体を回収する工程、
(4)回収した複合体を電気化学測定に供し、それによりフェロセンを検出する工程
を含み、
前記(4)の工程が、回収した複合体の存在下、フェロセンの酸化電位においてL-プロリン脱水素酵素によるL-プロリンの酸化反応を生じさせ、それにより発生した電流を測定することを含む、前記方法。

【請求項2】
 
第1の粒子の平均粒径が100~500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10~100nmである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】
 
第1のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
第1の領域と第2の領域とが、標的微生物のDNAの該一鎖中で50~20000塩基離れた位置に存在する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
 
標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】
 
(1)標的微生物のDNAの一鎖中の第1の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第1のプローブが表面に担持されておりかつ磁性を有する少なくとも1つの第1の粒子と、(2)該一鎖中の第1の領域とは重複しない第2の領域の塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有する第2のプローブおよびフェロセンが表面に担持されている非磁性金属ナノ粒子からなる少なくとも1つの第2の粒子と、(3)L-プロリン脱水素酵素およびL-プロリンとを組み合わせてなる、検査試料中の標的微生物の検出用試薬キット。

【請求項8】
 
第1の粒子の平均粒径が100~500nmであり、かつ、第2の粒子の平均粒径が10~100nmである、請求項7に記載の試薬キット。

【請求項9】
 
非磁性金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項7または8に記載の試薬キット。

【請求項10】
 
第1のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドであり、かつ、第2のプローブが20~100塩基のオリゴヌクレオチドである、請求項79のいずれか1項に記載の試薬キット。

【請求項11】
 
第1の領域と第2の領域とが、標的微生物のDNAの該一鎖中で50~20000塩基離れた位置に存在する、請求項710のいずれか1項に記載の試薬キット。

【請求項12】
 
標的微生物が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カンピロバクター属菌、サルモネラ属菌、腸管出血性大腸菌、ビブリオ属菌、レジオネラ属菌およびセレウス菌からなる群から選択される1以上の微生物である、請求項711のいずれか1項に記載の試薬キット。
IPC(International Patent Classification)
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