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NOVEL UBIQUITIN LIGASE AND USE THEREOF foreign

Patent code P160013052
File No. 5093
Posted date Jun 15, 2016
Application number P2011-525944
Patent number P5234865
Date of filing Aug 6, 2010
Date of registration Apr 5, 2013
International application number JP2010063345
International publication number WO2011016540
Date of international filing Aug 6, 2010
Date of international publication Feb 10, 2011
Priority data
  • P2009-184878 (Aug 7, 2009) JP
Inventor
  • (In Japanese)岩井 一宏
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人京都大学
Title NOVEL UBIQUITIN LIGASE AND USE THEREOF foreign
Abstract (In Japanese)直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有し、効率よく発現および精製が可能な新規なユビキチンリガーゼを提供する。(a)HOIPの一部からなり、少なくともUBA領域およびRING-IBR-RING領域を含むタンパク質と、(b)前記(a)と複合体を形成する1種または2種以上のタンパク質との複合体は、直鎖状ポリユビキチン鎖形成活性を有し、効率よく発現および精製が可能な新規なユビキチンリガーゼであることを見出した。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ユビキチン修飾系はユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵素(E2)、ユビキチンリガーゼ(E3)の3種の酵素群の働きで、ユビキチンリガーゼが選択的に識別する基質、主としてタンパク質にユビキチンが数珠状に連なったポリユビキチン鎖を付加することで、タンパク質の機能を制御する翻訳後修飾系である。発見当初は、ポリユビキチン化タンパク質はすべて分解に導かれると考えられてきたが、その概念は拡大し、現在では多彩な様式でタンパク質の機能を制御することが明らかになっている。生体にはユビキチン間の結合様式が異なる多様なポリユビキチン鎖が存在し、その種類によって修飾されたタンパク質の制御様式が異なることが示されつつある。従来のポリユビキチン鎖はユビキチンのリジン側鎖を介したイソペプチド結合によって生成されると考えられてきたが、本発明者はN末端のメチオニンを介する直鎖状ポリユビキチン鎖が形成されること、および、直鎖状ポリユビキチン化がNF-κBの活性化に関わることを世界に先駆けて示した。

具体的には、本発明者は、HOIL-1LとHOIPとの複合体が直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼであることを見出し、HOIL-1LとHOIPとの複合体をLUBAC(linear ubiquitin chain assemble complex)と命名した(非特許文献1参照)。また、LUBACユビキチンリガーゼは、NF-κB活性化の古典的経路において、IκBキナーゼを活性化する段階に関与しており、IκBキナーゼであるIKK複合体を構成するNEMO(NF-κB essential modulator)を直鎖状ユビキチン化することで、NF-κBの選択的な活性化を引き起こすことを明らかにした(非特許文献2参照)。

さらに本発明者は、Sharpinも直鎖状ポリユビキチン鎖を生成するユビキチンリガーゼの構成成分であることを見出し、Sharpin、HOIL-1LとHOIPの3つのタンパク質、またはHOIL-1LとHOIPもしくはSharpinとHOIPの2つのタンパク質で構成されるユビキチンリガーゼ複合体をLUBACと呼称することにした。Sharpinに関しては、cpdmマウスと呼ばれるSharpinの自然変異マウスは、慢性皮膚炎やパイエル板の欠損など免疫系の異常等の症状を呈することが報告されている(非特許文献3参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、新規なユビキチンリガーゼおよびその利用に関するものであり、詳細には、複数のタンパク質の複合体からなる新規なユビキチンリガーゼ、当該ユビキチンリガーゼの構成タンパク質を発現する発現ベクター、当該発現ベクターが導入された形質転換体、および当該ユビキチンリガーゼを用いる直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の(a)と(2)との複合体、または、(a)と(1)と(2)との複合体からなるユビキチンリガーゼ。
(a)HOIPの一部からなり、少なくともUBA領域およびRING-IBR-RING領域を含むタンパク質
(1)HOIL-1L、もしくは、HOIL-1Lの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク質
(2)Sharpin、もしくは、Sharpinの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク質

【請求項2】
 
前記(1)が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記(2)が、配列番号12で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号12で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項1に記載のユビキチンリガーゼ。

【請求項3】
 
前記(a)が、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号7で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項1に記載のユビキチンリガーゼ。

【請求項4】
 
被験物質を請求項1~3のいずれかに記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、
前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、
前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。

【請求項5】
 
請求項1に記載のユビキチンリガーゼを製造する方法であって、
以下の(a)および(2)のタンパク質、または、(a)および(1)および(2)のタンパク質を組み換えタンパク質として細菌に発現させるタンパク質発現工程と、
細菌内または培地中から(a)と(2)との複合体、または、(a)と(1)と(2)との複合体を精製する複合体精製工程とを包含し、
細菌に発現させる組み換えタンパク質の少なくとも一種にタグ配列が付加されており、当該タグ配列を利用した1段階の精製により複合体を回収することを特徴とするユビキチンリガーゼの製造方法。
(a)HOIPの一部からなり、少なくともUBA領域およびRING-IBR-RING領域を含むタンパク質
(1)HOIL-1L、もしくは、HOIL-1Lの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク
2)Sharpin、もしくは、Sharpinの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク質

【請求項6】
 
前記(1)が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記(2)が、配列番号12で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号12で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項5に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。

【請求項7】
 
前記(a)が、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号7で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項5に記載のユビキチンリガーゼの製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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