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PHOTOCLEAVAGE METHOD OF PHOTOCROSSLINK OF PHOTOCROSSLINKING NUCLEIC ACID DOUBLE STRAND

Patent code P160013196
File No. S2015-0115-N0
Posted date Aug 9, 2016
Application number P2014-224574
Publication number P2016-086724A
Patent number P6481161
Date of filing Nov 4, 2014
Date of publication of application May 23, 2016
Date of registration Feb 22, 2019
Inventor
  • (In Japanese)藤本 健造
  • (In Japanese)中村 重孝
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
Title PHOTOCLEAVAGE METHOD OF PHOTOCROSSLINK OF PHOTOCROSSLINKING NUCLEIC ACID DOUBLE STRAND
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To cleave the photocrosslink between strands of a nucleic acid double strand by photoirradiation with long wavelength at low temperature with high efficiency.
SOLUTION: The invention provides a method for photocleavage of a photocrosslink by photoirradiation to a photocrosslinking nucleic acid double strand having a photocrosslink formed of a photoresponsive base between the strands within a nucleic acid double strand, wherein the photocrosslinking nucleic acid double strand is double-stranded with a strand of photoresponsive-modified nucleic acid having a photoresponsive base having a photo-crosslinkable vinyl structure and an object strand of photo-crosslinkable nucleic acid having a complementary sequence to the photoresponsive-modified nucleic acid; the strand of photoresponsive-modified nucleic acid and the object strand of photo-crosslinked nucleic acid are photo-crosslinked by the photoresponsive base; a photo-crosslinking nucleic acid double strand has a single strand portion at the terminal of the double strand; a strand of an inserting nucleic acid having a sequence complementary to the single strand portion of a strand having the single stranded portion of the terminal and the double stranded portion is added in the manner that it can contact with the photocrosslinking nucleic acid double strand in a solution; and photoirradiation is performed.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

分子生物学的の分野において、核酸の連結と切断は、あらゆる応用の基礎となる重要な基本技術である。

光反応による核酸の連結の技術として、5-シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術(特許文献1:特許第3753938号、特許文献2:特許第3753942号)、3-ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシド又はヌクレオシドアナログを使用した光架橋技術(特許文献3:特許第4814904号、特許文献4:特許第4940311号、特許文献5:国際公開WO2014/157565A1号公報)がある。これらの技術によって核酸二重鎖の鎖間に光架橋を形成することができる。この光架橋は、共有結合による架橋であり、化学的に安定であるが、光反応によって再び開裂することができる。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、光架橋核酸二重鎖の光架橋を光開裂させる方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
核酸二重鎖内の鎖間に光応答性塩基によって形成された光架橋を有する、光架橋核酸二重鎖に対して、光照射して、光架橋を光開裂させる方法であって、
光架橋核酸二重鎖は、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基を有する光応答性修飾核酸の鎖と、該光応答性修飾核酸に対して相補的な配列を有する被光架橋性核酸の鎖とによって二重鎖形成され、
光応答性修飾核酸の鎖と被光架橋性核酸の鎖とは、光応答性塩基によって光架橋され、
光架橋核酸二重鎖は、二重鎖の末端に一重鎖部分を有しており、
該末端の一重鎖部分を有する鎖の一重鎖部分と二重鎖部分に対して相補的な配列を有する挿入核酸の鎖を、光架橋核酸二重鎖と溶液中で接触可能に添加して、光照射する工程、
を含む、方法であり、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基を有する光応答性修飾核酸が、次の式(I):
【化1】
 
(省略)
(ただし、式I中、R11は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R12及びR13は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、C2~C7のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
R4は、水素を表し、
R5は、水酸基を表し、
R6は、水素又は水酸基である)
で表される修飾ヌクレオシドが、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基として、リン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入されてなる修飾核酸である、方法

【請求項2】
 
応答性塩基によって形成された光架橋が、
光応答性修飾核酸の塩基配列中の光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、
被光架橋性核酸の塩基配列中のT又はUとの間に形成された光架橋である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
末端の一重鎖部分を有する鎖が、光応答性修飾核酸の鎖、又は挿入核酸の鎖であり、
該末端の一重鎖部分が、光応答性修飾核酸の鎖の3’末端又は5’末端、または挿入核酸の鎖の3’末端又は5’末端である、請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
 
光架橋核酸二重鎖の末端の一重鎖部分が、1~30塩基の塩基長である、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
末端の一重鎖部分を有する鎖の一重鎖部分と二重鎖部分に対して相補的な配列を有する挿入核酸の鎖が、一重鎖、又は一重鎖部分を有する二重鎖である、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
 
末端の一重鎖部分を有する鎖が、光応答性修飾核酸の鎖であり、
末端の一重鎖部分が、光応答性修飾核酸の鎖の3’末端又は5’末端であり、
挿入核酸の鎖が、光応答性修飾核酸に対して相補的な配列を有する一重鎖である、請求項1~5のいずれかに記載の方法。

【請求項7】
 
光照射が、312~400nmの範囲の波長の光照射によって行われる、請求項1~6のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
 
光照射が、1~60℃の範囲の温度において行われる、請求項1~7のいずれかに記載の方法。

【請求項9】
 
光照射が、4~40℃の範囲の温度において行われる、請求項1~7のいずれかに記載の方法。

【請求項10】
 
請求項1~9のいずれかに記載の方法によって、
核酸二重鎖内の鎖間の光架橋を光開裂させて、光架橋されていない光応答性修飾核酸を、製造する方法。

【請求項11】
 
請求項1~9のいずれかに記載の方法によって、
核酸二重鎖内の鎖間の光架橋を光開裂させて、光架橋されていない被光架橋性核酸を、製造する方法。

【請求項12】
 
請求項1~9のいずれかに記載の挿入核酸からなる、光架橋核酸二重鎖用光開裂促進剤。

【請求項13】
 
請求項1~9のいずれかに記載の挿入核酸の、光架橋核酸二重鎖内光開裂促進のための使用。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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