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(In Japanese)神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイス meetings

Patent code P160013430
File No. (AF19P007)
Posted date Nov 2, 2016
Application number P2014-536618
Patent number P6047579
Date of filing Mar 21, 2013
Date of registration Nov 25, 2016
International application number JP2013057976
International publication number WO2014045618
Date of international filing Mar 21, 2013
Date of international publication Mar 27, 2014
Priority data
  • P2012-205561 (Sep 19, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)宇理須 恒雄
  • (In Japanese)ワン ツーホン
  • (In Japanese)宇野 秀隆
  • (In Japanese)西藤 美穂
  • (In Japanese)長岡 靖崇
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイス meetings
Abstract (In Japanese)培地中で生きた状態にある神経細胞の移動を制約しつつ、神経細胞ネットワークを構成できる神経細胞ネットワーク形成用培養装置と、その利用手段を提供する。
細胞培地を充填可能な平坦基板上に複数の突起部で囲まれた細胞定着部を形成し、かつ、(1)複数の突起部間には神経細胞の細胞体を通過させない程度に広い間隔を設定し、(2)細胞定着部が1~数個の神経細胞の細胞体を収容できる内径を持ち、(3)細胞定着部の底面である基板面には細胞外マトリクス形成物質をコーティングし、及び/又は、基板面下部側の吸引装置による培地吸引用の微細貫通孔を備える、神経細胞ネットワーク形成用培養装置。
【選択図】
 図5
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来、研究目的あるいは実用目的から、培地(特に液体培地)中に神経細胞を保持して、神経細胞が生きたままの状態で神経細胞ネットワークをin vitroで構成しようとする提案がなされている。

例えば下記の非特許文献1では、図2に示すようにトランジスターを配置したSi基板上に複数の突起部で囲まれた領域を設け、ここに巻貝(stagnalis)の末梢神経細胞集合体である大きな神経節(ganglion)を配置して、神経細胞の電位変動を検出している。下記の非特許文献2では、基板上に図3に示すような「ケージ」と称する略円盤形の囲い(高さ約9μm)を複数形成し、各ケージの中央部のスペースに神経細胞を配置すると共に、ケージに設けた幾つかのトンネルを通じて神経細胞の軸索等を隣接のケージ中の神経細胞に向かって伸長させるニューロチップを開示している。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は神経細胞ネットワークの形成及びその利用、並びに神経細胞播種デバイスに関する。更に詳しくは本発明は、神経細胞の軸索と他の神経細胞の樹状突起によるシナプス接合を介した神経細胞ネットワーク(neural network)を培養下に形成させる神経細胞ネットワーク形成用培養装置と、同装置を用いてそのような神経細胞ネットワークを形成する方法に関する。更に本発明は、このような神経細胞ネットワークを用いたハイスループットスクリーニング(high throughput screening)技術、プレーナーパッチクランプ(planar patch-clamp)技術、神経細胞イメージング技術等に関する。

更に本発明は、神経細胞ネットワーク形成用培養装置又はこの培養装置を利用したプレーナーパッチクランプ装置における多数の選択領域(細胞定着部)に効率的に神経細胞を播種するための神経細胞播種デバイスに関する。

本発明において、「神経細胞」とは、第1に、中枢神経細胞、末梢神経細胞等の各種の神経細胞を包含する。神経細胞としては、未だ軸索や樹状突起を突出させていない状態のものが好ましい。又、「神経細胞」とは、第2に、例えばiPS細胞やES細胞のように神経細胞に分化可能な細胞、より好ましくは、iPS細胞やES細胞から神経細胞への分化の完成途上にある神経幹細胞等の状態にあるものを包含する。更に、「神経細胞」とは、第3に、細胞相互間にネットワークを形成する性質を持つ細胞、及び、細胞相互間にネットワークを形成する性質を持つ細胞に分化が可能な細胞も包含する。
又、「神経細胞の細胞体」とは、神経細胞における軸索や樹状突起のような突出部分を除いた細胞の本体部分を言う。

更に、「選択領域」又は「細胞定着部」とは、神経細胞ネットワーク形成の中心となり、又はイオンチャンネル電流計測や各種イメージングにおける電流/電圧印加等の対象となるべき神経細胞が配置される基板上の領域を言い、「選択細胞」とは、選択領域(細胞定着部)に配置される神経細胞を言う。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
貫通孔を有する電気絶縁性基板と、当該電気絶縁性基板の第一表面側に形成された第一液溜部と、その反対側である第二表面側に形成された第二液溜部と、第一液溜部及び第二液溜部に導入される導電性液体に対してそれぞれ通電可能に配置された電極部を含む、神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置であって、
電気絶縁性基板の第一表面側の貫通孔の周縁に複数の突起部で囲まれた細胞定着部を備え、ここで、複数の突起部が、神経細胞の細胞体を通過させない間隔を有し、そして
電極部が、以下の(a)~(c)
(a)前記液溜部に導電性液体が導入された際にその導電性液体に接することとなる容器壁の少なくとも一部が無機多孔質材料で構成されている電極容器;
(b)上記の電極容器内に収容された、貴金属Nmの表層部にその貴金属の塩化物NmCl層を形成した電極;
(c)上記の電極容器内に充填された、前記貴金属の塩化物NmCl及びアルカリ金属塩化物が飽和濃度で溶解した電極溶液;
を備えることを特徴とする、前記神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。

【請求項2】
 
前記複数の突起部により規定される細胞定着部の内径が、1~数個の神経細胞の細胞体を収容できるサイズである、請求項1に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。

【請求項3】
 
前記細胞定着部を構成する基板面に、細胞外マトリクス形成物質がコーティングされている、請求項1又は2に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。

【請求項4】
 
前記電気絶縁性基板上に、複数の貫通孔及び細胞定着部を備え、神経細胞ネットワークの形成を可能にする間隔で細胞定着部が配置される、請求項1~3のいずれか一項に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。

【請求項5】
 
前記神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置が以下(A)~(C)のいずれかの目的に使用されるものであることを特徴とする請求項1~4のいずれか1項に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。
(A)神経細胞ネットワークにおける神経細胞イオンチャンネル電流の計測・解析に用いる。
(B)少なくとも、Caイメージング解析、前シナプス部位のマーカーであるsynaptophysin又は synapsinの標識によるイメージング解析、樹状突起のマーカーであるMAP2の標識によるイメージング解析、及び、エンドソームやエキソソームを標識するFM1-43又はFM4-64によるイメージング解析を包含するイメージング解析に用いる。
(C)神経細胞ネットワークのハイスループットスクリーニングシステムに用いる。

【請求項6】
 
前記神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置が請求項5の(B)に記載のイメージング解析に用いるものである場合に、更に下記(D)~(F)の1以上の要素を備えることを特徴とする請求項5に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置。
(D)前記基板の上部に、神経細胞が発する光の受光装置を設置している。
(E)前記基板の上部に、神経細胞あるいは基板表面に光を照射する照射装置を設置している。
(F)上記(E)の照射装置は、所定の単一の神経細胞にのみ光を照射するための集光系を装備している。

【請求項7】
 
請求項1~6のいずれか1項に記載の神経細胞ネットワーク用培養型プレーナーパッチクランプ装置を用いて、任意の研究目的のもとに培養下の神経細胞ネットワークを形成させる方法であって、
(1)細胞培地充填下の前記板上に神経細胞を播種する工程と、
(2)細胞定着部の細胞外マトリクス形成物質により、及び/又は、細胞定着部の底面の微細貫通孔から液体培地を吸引することにより、一つの細胞定着部ごとに1~数個の神経細胞を配置・定着させる工程と、
(3)細胞定着部に定着した神経細胞の移動を複数の突起部により制約しつつ、複数の突起部の間隔部分により相互に相手の神経細胞の存在を認識させて軸索又は樹状突起による神経細胞間のシナプス接合を形成させる工程と、
を含むことを特徴とする神経細胞ネットワーク形成方法。

【請求項8】
 
前記神経細胞ネットワーク形成方法において、(1)の工程で神経細胞を播種する際、併せてグリア細胞を細胞定着部以外の部分に播種することを特徴とする請求項7に記載の神経細胞ネットワーク形成方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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