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DNA BINDING DOMAIN INTEGRATION VECTOR AND SET THEREOF, FUSION PROTEIN-CODING VECTOR AND SET THEREOF AND PRODUCTION METHOD THEREOF, DESTINATION VECTOR, PLANT CELL EXPRESSION VECTOR AND PRODUCTION METHOD THEREOF, KIT FOR PRODUCING PLANT CELL EXPRESSION VECTOR, TRANSGENIC METHOD, AND GENOME EDITING METHOD UPDATE_EN

Patent code P160013493
File No. S2015-0518-N0
Posted date Nov 10, 2016
Application number P2015-051424
Publication number P2016-163556A
Patent number P6590333
Date of filing Mar 13, 2015
Date of publication of application Sep 8, 2016
Date of registration Sep 27, 2019
Priority data
  • P2015-037195 (Feb 26, 2015) JP
Inventor
  • (In Japanese)島田 浩章
  • (In Japanese)草野 博彰
Applicant
  • (In Japanese)学校法人東京理科大学
Title DNA BINDING DOMAIN INTEGRATION VECTOR AND SET THEREOF, FUSION PROTEIN-CODING VECTOR AND SET THEREOF AND PRODUCTION METHOD THEREOF, DESTINATION VECTOR, PLANT CELL EXPRESSION VECTOR AND PRODUCTION METHOD THEREOF, KIT FOR PRODUCING PLANT CELL EXPRESSION VECTOR, TRANSGENIC METHOD, AND GENOME EDITING METHOD UPDATE_EN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently introducing, into a plant cell, a plural of fusion proteins in which TALE DNA binding domain is linked to a protein having biological activities, such as a FokI DNA cleavage domain, and to provide a vector group usable for it.
SOLUTION: The invention provides a DNA binding domain integration vector containing a first attL recombinant site, a TALE DNA binding domain insertion area, a gene coding a protein, a second attL recombinant site, in which the first attL recombinant site, the insertion area, the gene, and the second attL recombinant site are arranged from the upstream of a protein coding direction toward the downstream in this order, and no promoter is arranged between the first attL recombinant site and an insertion site. The invention also provides a destination vector that is recombinable with the DNA binding domain integration vector, and has a promoter pair facing the opposite direction; and a method and kit using those vectors.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

Transcription activator-like effector nucleases(TALEN)は、植物に対する細菌病原体であるXanthomonas由来のタンパク質であるTranscription activator-like effector(TALE)と、FokIのDNA切断ドメインとを連結した人工融合タンパク質である。TALEの中には、典型的にはLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG(配列番号1)で表される通常34アミノ酸長の配列が繰り返された中央繰り返しドメイン(central repeat domain)が存在する。繰り返し数は概ね1.5~33.5であり、つまりC末端の最後の繰り返しは完全なものではなく、2アミノ酸残基のみとなっている(half repeat)。上記の配列の12番目および13番目のアミノ酸残基は可変であり、TALEが結合するDNA配列に対する特異性を決めている。これら2つのアミノ酸残基はrepeat variable diresidue(RVD)とも呼ばれ、この2アミノ酸残基の配列と、認識されるヌクレオチドとの間には固定した関係が存在する。

このため、各繰り返しにおけるRVDの配列を改変することにより、TALEは一定の範囲内の長さを有する任意のDNA配列に結合可能となる。TALEがDNA配列に結合すると、TALEに連結したFokIヌクレアーゼが作用して、その近傍でDNAを切断する。この技術によれば、従来の制限酵素が有していた認識配列についての制約が大きく解消される。

今から始めるゲノム編集(羊土社2014、p191)にはTALEN構成用ベクターが開示されており、プロモーターの下流にTALEのDNA結合ドメインを導入している。このベクターは制限酵素を用いてさらなるクローニングを受ける。また、Zhang et al., PLOS ONE(November 2013 | Volume 8 Issue 11, e80281)には動物細胞でTALENを発現するためのTALEN構成用ベクターが記載されており、やはりプロモーターの下流にTALEのDNA結合ドメインを導入している。

また、核酸を細胞に導入することにより、当該核酸にコードされたタンパク質やRNAを発現させることも行われている。細胞を核酸に導入する技術については、例えば細菌である大腸菌については広く研究されており、例えば、対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得られるコンピテントセルをDNA存在下で熱処理するなどの方法により、核酸を導入することが出来る。また、動物細胞の場合にはリポフェクション(核酸含有リポソームを動物細胞内に導入する方法)、エレクトロポレーション(電気パルスにより細胞膜に穴をあけ、核酸を動物細胞内に導入する方法)、マイクロインジェクション(ガラスのマイクロピペットを用いて、DNAを動物細胞内に注入する方法)、パーティクル・ガン法(金属の微粒子をDNAでコーティングし、動物細胞内に打ち込む方法)、およびウイルスベクターを利用して遺伝子を動物細胞内に導入する方法などがある。特に、マイクロインジェクションなどの方法を用いれば、DNAを高い確実性で動物細胞内に導入することが可能である。

しかし、これらの方法の多くは、植物細胞には適用できない。植物細胞には細胞壁が存在し、このために、マイクロインジェクションなどの方法を採ることは出来ない。植物細胞の形質転換方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法や、パーティクル・ガン法などがあるだけである。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、DNA結合ドメイン組込み用ベクターおよびそのセット、融合タンパク質コーディングベクターおよびそのセットならびにその製造方法、デスティネーションベクター、植物細胞用発現ベクターおよびその製造方法、植物細胞用発現ベクター作製用キット、形質転換方法、ならびにゲノム編集方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(a)第1の融合タンパク質コーディングベクター、第2の融合タンパク質コーディングベクター、およびデスティネーションベクターを準備すること、ここで、
前記第1の融合タンパク質コーディングベクターは、
第1のattL組換え部位と、
TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記TALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子と、
第2のattL組換え部位と、
を含み、
前記第1の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第1のattL組換え部位、前記TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第2のattL組換え部位は、前記FokIのDNA切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第1のattL組換え部位と前記TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターは存在せず、
前記第2の融合タンパク質コーディングベクターは、
第3のattL組換え部位と、
TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメントと、
前記TALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子と、
第4のattL組換え部位と、
を含み、
前記第2の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第3のattL組換え部位、前記TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメント、前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第4のattL組換え部位は、前記FokIのDNA切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第3のattL組換え部位と前記TALEのDNA結合ドメインをコードする核酸セグメントとの間に、プロモーターは存在せず、
前記デスティネーションベクターは、第1のDNAブロックおよび第2のDNAブロックを含み、
前記第1のDNAブロックは、
植物細胞で作動可能な第1のプロモーターと、
第1のattR組換え部位と、
第2のattR組換え部位と、
を含み、
前記第2のDNAブロックは、
植物細胞で作動可能な第2のプロモーターと、
第3のattR組換え部位と、
第4のattR組換え部位と、
を含み、
前記第2のDNAブロックは前記第1のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第1のDNAブロックとは逆向きに配置されており、前記第1のDNAブロックにおいて、前記第1のプロモーター、前記第1のattR組換え部位および前記第2のattR組換え部位は、前記第1のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第2のDNAブロックにおいて、前記第2のプロモーター、前記第3のattR組換え部位および前記第4のattR組換え部位は、前記第2のプロモーターがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、
前記第1のattL組換え部位は、attL1~attL4から選択される1種であり、前記第2のattL組換え部位は、attL1~attL4から選択され、かつ前記第1のattL組換え部位とは異なる1種であり、前記第3のattL組換え部位は、attL1~attL4から選択される1種であり、前記第4のattL組換え部位は、attL1~attL4から選択され、かつ前記第3のattL組換え部位とは異なる1種であり、
前記第1のattR組換え部位は、attR1~attR4から選択され、かつ前記第1のattL組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第2のattR組換え部位は、attR1~attR4から選択され、前記第1のattR組換え部位とは異なり、かつ前記第2のattL組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第3のattR組換え部位は、attR1~attR4から選択され、かつ前記第3のattL組換え部位と組換え可能な一種であり、前記第4のattR組換え部位は、attR1~attR4から選択され、前記第3のattR組換え部位とは異なり、かつ前記第4のattL組換え部位と組換え可能な一種である、ならびに
(b)第1の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第1のattL組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第1のattR組換え部位と組換え、前記第1の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第2のattL組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第2のattR組換え部位と組換え、前記第2の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第3のattL組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第3のattR組換え部位と組換え、かつ、前記第2の融合タンパク質コーディングベクターにおける前記第4のattL組換え部位を、前記デスティネーションベクターにおける前記第4のattR組換え部位と組換えること、
を含む、植物細胞用TALEN発現ベクターの製造方法。

【請求項2】
 
前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子がイントロンを含む、請求項1に記載の方法

【請求項3】
 
前記第1の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第1のattL組換え部位と前記第2のattL組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含および/または前記第2の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第3のattL組換え部位と前記第4のattL組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法

【請求項4】
 
前記第1の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第1のattL組換え部位と前記第2のattL組換え部位との間に第1のマーカー遺伝子を含かつ
前記第2の融合タンパク質コーディングベクターは、前記第3のattL組換え部位と前記第4のattL組換え部位との間に、第1のマーカー遺伝子とは異なる第2のマーカー遺伝子を含む、請求項3に記載の方法

【請求項5】
 
(c) 第1のattL組換え部位と、
可変領域を有するTALE(TAL effector)のDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な、制限酵素による切断可能位置である挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にTALEのDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にTALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子と、
第2のattL組換え部位と、
を含み、
前記第1のattL組換え部位、前記挿入領域、前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第2のattL組換え部位は、前記FokIのDNA切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第1のattL組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、第1のDNA結合ドメイン組込み用ベクターを準備し、
前記第1のDNA結合ドメイン組込み用ベクターを前記制限酵素で切断して、前記挿入位置に、TALEのDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで第1の融合タンパク質コーディングベクターを得ること、ならびに
(d) 第3のattL組換え部位と、
可変領域を有するTALE(TAL effector)のDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入可能な、制限酵素による切断可能位置である挿入位置を有する挿入領域と、
前記挿入位置にTALEのDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントが挿入された場合にTALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質をコードする核酸配列を形成可能となるように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子と、
第4のattL組換え部位と、
を含み、
前記第3のattL組換え部位、前記挿入領域、前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子、および前記第4のattL組換え部位は、前記FokIのDNA切断ドメインがコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第3のattL組換え部位と前記挿入位置との間に、プロモーターを有しない、第2のDNA結合ドメイン組込み用ベクターを準備し、
前記第2のDNA結合ドメイン組込み用ベクターを前記制限酵素で切断して、前記挿入位置に、TALEのDNA結合ドメインの可変繰り返し配列をコードする核酸セグメントを挿入することで第2の融合タンパク質コーディングベクターを得ること、をさらに含む、
請求項1~請求項4のうちいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】
 
前記制限酵素がBsaIまたはEsp3Iである、請求項5に記載の方法。

【請求項7】
 
前記デスティネーションベクターが、前記第1のDNAブロックにおける前記第1のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第2のattR組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列RBを有する核酸セグメントと、前記第2のDNAブロックにおける前記第2のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第4のattR組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列LBを有する核酸セグメントと、をさらに含む、請求項1~請求項6のうちいずれか一項に記載の方法

【請求項8】
 
請求項1~請求項7のうちいずれか一項に記載の方法により植物細胞用TALEN発現ベクターを製造すること、および
前記植物細胞用TALEN発現ベクターを植物細胞に導入すること
を含む、前記植物細胞用TALEN発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法。

【請求項9】
 
前記導入することが、前記植物細胞用TALEN発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用TALEN発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、
前記デスティネーションベクターは、前記第1のDNAブロックにおける前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第2のattR組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列RBをコードする核酸セグメントと、前記第2のDNAブロックにおける前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第4のattR組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列LBをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、請求項8に記載の方法。

【請求項10】
 
請求項1~請求項7のうちいずれか一項に記載の方法により植物細胞用TALEN発現ベクターを製造すること、
前記植物細胞用TALEN発現ベクターを植物細胞に導入すること、
前記導入された植物細胞用TALEN発現ベクターから前記FokIのDNA切断ドメインを発現させること、および
前記FokIのDNA切断ドメインを植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、
前記FokIのDNA切断ドメインが、前記TALEのDNA結合ドメインと共にTALEN融合タンパク質を形成しており、
前記FokIのDNA切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記TALEのDNA結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法。

【請求項11】
 
第1のDNAブロックおよび第2のDNAブロックを含む植物細胞用TALEN発現ベクターであって、
前記第1のDNAブロックは、
植物細胞で作動可能な第1のプロモーターと、
第1のattB組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なTALEのDNA結合ドメインをコードする第1の核酸セグメントと、
前記TALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする第1の遺伝子と、
第2のattB組換え部位と、
を含み、
前記第2のDNAブロックは、
植物細胞で作動可能な第2のプロモーターと、
第3のattB組換え部位と、
特定の核酸配列に結合可能なTALEのDNA結合ドメインをコードする第2の核酸セグメントと、
前記TALEのDNA結合ドメインとの融合タンパク質を形成するように位置する、FokIのDNA切断ドメインをコードする第2の遺伝子と、
第4のattB組換え部位と、
を含み、
前記第2のDNAブロックは前記第1のプロモーターの上流側に位置し、かつ前記第1のDNAブロックとは逆向きに配置されており、前記第1のDNAブロックにおいて、前記第1のプロモーター、前記第1のattB組換え部位、前記第1の核酸セグメント、前記第1の遺伝子および前記第2のattB組換え部位は、前記第1の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており、前記第2のDNAブロックにおいて、前記第2のプロモーター、前記第3のattB組換え部位、前記第2の核酸セグメント、前記第2の遺伝子および前記第4のattB組換え部位は、前記第2の遺伝子がコードされている方向における上流側から下流側に向かってこの順に配置されており
前記第1のattB組換え部位は、attB1~attB4から選択され、前記第2のattB組換え部位は、attB1~attB4から選択され、かつ前記第1のattB組換え部位とは異なる1種であり、前記第3のattB組換え部位は、attB1~attB4から選択され、前記第4のattB組換え部位は、attB1~attB4から選択され、かつ前記第3のattB組換え部位とは異なる1種である、植物細胞用TALEN発現ベクター。

【請求項12】
 
前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子がイントロンを含む、請求項11に記載の植物細胞用TALEN発現ベクター。

【請求項13】
 
前記第1のDNAブロックは、前記第1のattB組換え部位と前記第2のattB組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含み、および/または前記第2のDNAブロックは、前記第3のattB組換え部位と前記第4のattB組換え部位との間にマーカー遺伝子をさらに含む、請求項11または請求項12に記載の植物細胞用TALEN発現ベクター。

【請求項14】
 
前記第1のDNAブロックは、前記第1のattB組換え部位と前記第2のattB組換え部位との間に第1のマーカー遺伝子を含み、かつ
前記第2のDNAブロックは、前記第3のattB組換え部位と前記第4のattB組換え部位との間に、第1のマーカー遺伝子とは異なる第2のマーカー遺伝子を含む、請求項13に記載の植物細胞用TALEN発現ベクター。

【請求項15】
 
前記第1のDNAブロックにおける前記第1のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第2のattB組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列RBを有する核酸セグメントと、前記第2のDNAブロックにおける前記第2のプロモーターがコードされた方向を基準として前記第4のattB組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列LBを有する核酸セグメントと、をさらに含む、請求項11~請求項14のうちいずれか一項に記載の植物細胞用TALEN発現ベクター。

【請求項16】
 
請求項11~請求項15のうちいずれか一項に記載の植物細胞用TALEN発現ベクターを植物細胞に導入することを含む、前記植物細胞用TALEN発現ベクターを遺伝子導入した植物細胞を作製する方法。

【請求項17】
 
前記導入することが、前記植物細胞用TALEN発現ベクターをアグロバクテリウムに導入すること、および前記アグロバクテリウムを植物細胞に感染させることにより、前記植物細胞用TALEN発現ベクターを前記植物細胞内に導入すること、を含み、
前記植物細胞用TALEN発現ベクターは、前記第1のDNAブロックにおける前記FokIのDNA切断ドメインをコードする第1の遺伝子がコードされた方向を基準として前記第2のattB組換え部位よりも下流側の位置に配置された右境界配列RBをコードする核酸セグメントと、前記第2のDNAブロックにおける前記FokIのDNA切断ドメインをコードする遺伝子がコードされた方向を基準として前記第4のattB組換え部位よりも下流側の位置に配置された左境界配列LBをコードする核酸セグメントと、をさらに含む、請求項16に記載の方法。

【請求項18】
 
請求項11~請求項15のうちいずれか一項に記載の植物細胞用TALEN発現ベクターを植物細胞に導入すること、
前記導入された植物細胞用TALEN発現ベクターから前記FokIのDNA切断ドメインを発現させること、および
前記FokIのDNA切断ドメインを植物細胞のゲノムに作用させること、を含むゲノム編集方法であって、
前記FokIのDNA切断ドメインが、前記TALEのDNA結合ドメインと共にTALEN融合タンパク質を形成しており、
前記FokIのDNA切断ドメインが前記植物細胞のゲノムにおける、前記TALEのDNA結合ドメインが結合可能な特定の配列の近傍を切断する、ゲノム編集方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2015051424thum.jpg
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