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REMOVAL METHOD OF REMOVAL TARGET DNA, DNA CASSETTE, AND EXPRESSION VECTOR UPDATE_EN commons

Patent code P160013533
File No. P2015-073224
Posted date Nov 29, 2016
Application number P2015-073224
Publication number P2016-189761A
Patent number P6611305
Date of filing Mar 31, 2015
Date of publication of application Nov 10, 2016
Date of registration Nov 8, 2019
Inventor
  • (In Japanese)房田 直記
Applicant
  • (In Japanese)学校法人神奈川大学
Title REMOVAL METHOD OF REMOVAL TARGET DNA, DNA CASSETTE, AND EXPRESSION VECTOR UPDATE_EN commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a removal method of a removal target DNA that has high reliability and excellent operability, a DNA cassette suitable for the removal method of a removal target DNA, and an expression vector.
SOLUTION: A removal method of a removal target DNA of the present invention has an expression process of introducing an expression vector having a DNA which codes site-specific recombinant enzyme derived from φK38-1 into a host cell, which has a region including two recognition sequences recognized by the site-specific recombinant enzyme and a removal target DNA sandwiched by the two recognition sequences in a genome DNA, and expressing the site-specific recombinant enzyme in the host cell. Further, a host cell of the present invention is a bacterial cell, and it is preferable that a cell of Rubrivivax gelatinosus out of the bacterial cell is more preferable.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来より、宿主細胞のゲノム中の遺伝子破壊や、遺伝挿入を行う際には、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を用いて、遺伝子破壊や遺伝子挿入された宿主細胞を選択する手法が用いられてる。

しかしながら、マーカー遺伝子DNAは、目的の形質転換体を選択した後は不要であり、マーカー遺伝子DNAが残ることにより、形質転換体の操作の妨げとなる場合がある。そこで、形質転換体を得た後に、このマーカー遺伝子DNAを取り除くために、部位特異的組換え酵素を用いることが知られている。

部位特異的組換え酵素は、主に、チロシン型インテグラーゼと、セリン型インテグラーゼの2種類に分類される。

チロシン型インテグラーゼは、組換え反応に宿主側の因子を必要とする、必要とする認識配列が長い等の操作性が低いという問題を有する。

これに対し、セリン型インテグラーゼは、反応に宿主側の因子を必要としない、必要とする認識配列が短い等の、操作性において優れた性質を有することが知られている(例えば、非特許文献1を参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、除去標的DNAの除去方法、DNAカセット、及び発現ベクターに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれた除去標的DNAとを含む領域をゲノムDNA中に有する宿主細胞に、前記部位特異的組換え酵素をコードするDNAを有する発現ベクターを導入し、前記宿主細胞内において前記部位特異的組換え酵素を発現させる発現工程を有
前記2つの認識配列のうち、一方が、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のDNAであり、他方が、以下の(d)から(f)のいずれかに記載のDNAである、除去標的DNAの除去方法。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に記載の塩基配列を有するDNA
(e)配列番号2に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(f)配列番号2に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA

【請求項2】
 
前記発現工程の前に、φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれた除去標的DNAとを含む領域をゲノムDNA中に有する宿主細胞を得る工程を更に有する、請求項1に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項3】
 
前記宿主細胞を得る工程は、前記宿主細胞のゲノムDNA中における組換え標的遺伝子DNAと前記領域とを組み換え可能に構築されたターゲティングベクターを前記宿主細胞に導入する工程と、
前記ターゲティングベクターの導入後に、前記宿主細胞のゲノムDNA中における組換え標的遺伝子DNAが前記領域に組み換えられた宿主細胞を選択する第1の選択工程とを含み、
前記除去標的DNAは、第1のマーカー遺伝子DNAであり、
前記ターゲティングベクターは、前記第1のマーカー遺伝子DNAと異なる第2のマーカー遺伝子DNAを有し、
前記第1の選択工程は、前記第1のマーカー遺伝子DNA及び前記第2のマーカー遺伝子DNAを指標として行われる、請求項2に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項4】
 
前記第2のマーカー遺伝子DNAは、スクロース致死性遺伝子DNAである、請求項3に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項5】
 
前記除去標的DNAは、第1のマーカー遺伝子DNAであり、
前記発現ベクターは、前記第1のマーカー遺伝子DNAと、前記第1のマーカー遺伝子DNAと異なる第3のマーカー遺伝子DNAとを有し、
前記除去標的DNAの除去方法は、前記発現工程後に、前記第1のマーカー遺伝子DNA及び前記第3のマーカー遺伝子DNAを指標として、前記ゲノムDNA中における前記除去標的DNAが除去された前記宿主細胞を選択する第2の選択工程を更に有する、請求項1から4のいずれかに記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項6】
 
前記宿主細胞は、細菌細胞である、請求項1から5のいずれかに記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項7】
 
前記細菌細胞は、Rubrivivax gelatinosusの細胞である、請求項6に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項8】
 
前記第1のマーカー遺伝子DNAは、カナマイシン耐性遺伝子DNAであり、
前記第3のマーカー遺伝子DNAは、ストレプトマイシン耐性遺伝子DNAである、請求項6又は7に記載の除去標的DNAの除去方法。

【請求項9】
 
φK38-1由来の部位特異的組換え酵素により認識される2つの認識配列と、該2つの認識配列に挟まれたマーカー遺伝子DNAとを含む領域を有する、DNAカセットであって、
前記2つの認識配列のうち、一方が、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のDNAであり、他方が、以下の(d)から(f)のいずれかに記載のDNAである、DNAカセット。
(a)配列番号1に記載の塩基配列を有するDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(c)配列番号1に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA
(d)配列番号2に記載の塩基配列を有するDNA
(e)配列番号2に記載の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列を有するDNA
(f)配列番号2に記載の塩基配列と90%以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA

【請求項10】
 
前記マーカー遺伝子DNAが、配列番号3に記載の塩基配列を有する、請求項9に記載のDNAカセット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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