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METHOD OF DETECTING AND IDENTIFYING TARGET NUCLEIC ACID meetings

Patent code P160013576
Posted date Dec 28, 2016
Application number P2011-134800
Publication number P2013-000060A
Patent number P5863162
Date of filing Jun 17, 2011
Date of publication of application Jan 7, 2013
Date of registration Jan 8, 2016
Inventor
  • (In Japanese)福田 伸治
  • (In Japanese)桑山 勝
  • (In Japanese)重本 直樹
  • (In Japanese)谷澤 由枝
  • (In Japanese)山田 裕子
  • (In Japanese)松尾 健
Applicant
  • (In Japanese)広島県
Title METHOD OF DETECTING AND IDENTIFYING TARGET NUCLEIC ACID meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method of detecting and identifying a target nucleic acid that includes amplifying at least one kind of target nucleic acid simultaneously so that it can be visually identified.
SOLUTION: The method includes a process for labeling upstream and/or downstream primers with different fluorescent substances, a process for amplifying at least one kind of target nucleic acid simultaneously by adding primers for target nucleic acid amplification, including at least one fluorescent-labeled primer matching a method of amplifying target nucleic acids, for every kind of target nucleic acid, a process for adding an oligonucleotide that has a complementary sequence to the primer labeled with the fluorescent substance and that labels a quencher to a target nucleic acid amplifying solution amplified, to cause a reaction, and a process for applying light of a predetermined wavelength range to the target nucleic acid amplifying solution after the reaction, and detecting and identifying the amplified target nucleic acid based on a fluorescent color emitted from the fluorescent substance.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、患者などの生体などから採取した試料中の核酸を同定するための標的核酸の検出・識別方法に関する技術が開示されている。

例えば、標的核酸に対して、一方の末端が蛍光標識された第一プローブと、他方の末端がクエンチャーで標識された第二プローブとを同時にハイブリダイズさせ蛍光体とクエンチャーの相互作用による消光の様子を観察することにより、試料中に存在する特定の標的核酸量を調べる技術が開示され、蛍光プレートリーダーや蛍光光度計などの機器を使用して蛍光シグナルを測定している技術が開示されている(特許文献1参照。)。

また、PCR容器内に、検出すべき標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブを含まない反応液とともにある標的核酸を注入する工程と、該標的核酸反応液の上部に、検出すべき該標的核酸の配列に対して相補的塩基配列を有した標識プローブ混合液を注入する工程と、これに蓋をして核酸増幅させる工程と、核酸増幅後に遠心して反応液と標識プローブ混合液とを混合させる工程と、混合後に標識ブローブの分析をする工程とからなる技術が開示され、標的プローブのTm値の分析が融解曲線分析で行われる技術が開示されている(特許文献2参照。)。

Field of industrial application (In Japanese)

本願発明は、すべての生物の細胞に含まれている核酸を迅速に、簡易に、しかも複数の核酸を同時に検出・識別する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
検出しようする少なくとも1種類の標的核酸の種類ごとに添加する標的核酸増幅用のプライマーに対して検出用の異なる蛍光物質を標識する蛍光物質標識工程と、
標的核酸の種類ごとに、標的核酸を増幅させる方法に応じた前記標的核酸増幅用の、前記蛍光標識されたプライマーを添加して、少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる増幅工程と、を備える標的核酸の検出方法において、
前記増幅させた標的核酸増幅液に、前記蛍光物質を標識したプライマーと相補配列を有するクエンチャーを標識したオリゴヌクレオチドを添加させて反応させる反応工程と、前記反応後の標的核酸増幅液にあらかじめ定められた波長域の光を照射し、前記照射により蛍光物質から発せられた蛍光から増幅した標的核酸を検出し、前記蛍光の色から標的核酸を識別する検出・識別工程と、を含む工程からなることを特徴とする標的核酸の検出方法。

【請求項2】
 
前記プライマーに標識する蛍光物質が、前記プライマー配列の5’末端又は鎖内に標識されることを特徴とする請求項1に記載の標的核酸の検出方法。

【請求項3】
 
前記オリゴヌクレオチドに標識されたクエンチャーが、前記オリゴヌクレオチドの配列の5’末端、3’末端又は鎖内に標識された、前記蛍光物質から発せられる蛍光を消光する消光物質であることを特徴とする請求項1又は2に記載の標的核酸の検出方法。

【請求項4】
 
前記照射光の波長域が300~800nmであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項5】
 
少なくとも1種類の標的核酸を同時に増幅させる工程が、プライマーを用いて標的核酸を増幅させる方法であればいずれの増幅方法でもよいことを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項6】
 
標的核酸の種類ごとに対応させる上流側及び/又は下流側プライマーそれぞれの5’末端に、標的核酸の種類ごとに異なる蛍光物質を標識させた、同じ配列からなるオリゴヌクレオチドを連結させることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。

【請求項7】
 
複数の蛍光物質から発せられた蛍光によって目視で確認できる色が混色となっている場合に、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミンを添加することによって、混色を構成している複数の蛍光物質の中で一部の意図した蛍光物質からの緑色の蛍光色を消光させることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の標的核酸の検出方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2011134800thum.jpg
State of application right Registered


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