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PREPARATION METHOD FOR ELECTRON MICROSCOPE OBSERVATION SAMPLE

Patent code P160013590
File No. H26-047
Posted date Dec 28, 2016
Application number P2014-217925
Publication number P2016-085119A
Patent number P6281844
Date of filing Oct 27, 2014
Date of publication of application May 19, 2016
Date of registration Feb 2, 2018
Inventor
  • (In Japanese)祐村 恵彦
  • (In Japanese)沖田 圭丞
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title PREPARATION METHOD FOR ELECTRON MICROSCOPE OBSERVATION SAMPLE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a preparation method for an electron microscope observation sample, capable of observing an intracellular inherent fine structure without destruction of a cell structure.
SOLUTION: A preparation method for an electron microscope observation sample includes the steps of: (a) fixing a heat conductive film whose surface is coated with a thin film of carbon or noble metal by a fixing tool; (b) adhering the heat conductive film fixed in the step (b) to a cell; (c) rapidly freezing the cell by immersing the heat conductive film to which the cell (b) is adhered into a coolant cooled at -150°C or less; and (d) preparing the electron microscope observation sample from the cell rapidly cooled in the step (c).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

細胞内の微細構造の観察には、高分解能を持つ電子顕微鏡での観察が必須である。電子顕微鏡で観察するためには、電子線を用いるため、真空内で観察する必要がある。しかし、細胞の成分のうち80%以上が水であるため、真空中で細胞を生きたまま電子顕微鏡で観察するのは困難である。

そこで、従来、グルタルアルデヒドなどの架橋剤による化学固定法により、細胞内の構造を架橋して固定し、アルコールによって脱水して観察する方法が一般的であった。しかし、架橋剤は細胞内への浸透が遅く、固定するまでに構造が変化し、細胞内の本来の微細構造は維持されないという問題があった。

化学固定法の問題を克服するため、細胞を瞬時に急速凍結することで、生きたままの細胞内構造を観察する方法が提案されている。細胞を瞬時に急速凍結する方法としては、たとえば、透過型電子顕微鏡を用いて生物試料を観察するための試料を作製するために、生物試料を液体ヘリウム温度に冷却した金属ブロックに短時間押し付けて急速に凍結固定する方法(特許文献1参照)や、エタンを10~90%の割合でプロパンと混合した混合冷却剤を前記プロパンの融点より低い温度以下に冷却剤によって冷却し、この冷却状態の混合冷却剤に試料を浸漬して試料を急速に凍結する試料急速凍結方法(特許文献2参照)や、液体ヘリウム、液体窒素などで冷却された冷却金属面、あるいは冷却剤中に試料を落下させて急速凍結する方法(特許文献3参照)が提案されている。このような急速凍結を行えば、化学固定とは異なり、生きた細胞内の構造をそのまま維持できる利点がある。

しかしながら、かかる方法を行うために必要な急速凍結装置は複雑な構造のため非常に高価であり、かつ高度な技術を要するという問題や、細胞を金属ブロックに押し付けることや冷却剤中に落下させることによる物理的衝撃によって細胞が有する本来の微細構造を維持できないといった問題があった。さらに、凍結過程で細胞内の水が氷の結晶となり、さらに氷の結晶が成長することで細胞内の構造を破壊するという問題があった。

凍結速度をより速めることで細胞内の水を「無結晶の氷」として、細胞構造の破壊を防げることができると考えられる。しかし、一般的に細胞はカバーグラスに付着させており、カバーグラスに付着させた状態で急速凍結を行う場合、細胞のまわりや上には、ある程度の培養液などがある。細胞の厚みはおよそ5-10μmのため、無結晶の氷になるように凍結させるには、培養液の層をできるだけ除く必要がある。ただし、培養液の層をできるだけ除くと培養液がすぐに乾燥しやすく、その結果、細胞は変質もしくは死んでしまうために高度な技術や装置を要する。また、カバーグラスはガラスでできているため熱伝導度が低い。そのためにカバーグラス側からの凍結速度は遅く、カバーグラスと近接していない細胞の側から凍結が進む。その結果、カバーグラスに近接する部位は凍結に時間を要し、うまく無結晶の氷にならない。そこで、無結晶の氷となるように細胞を急速凍結して、細胞構造の破壊を防いだ電子顕微鏡観察試料の調製方法が求められていた。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、細胞構造の破壊がなく、細胞内の本来の微細構造を観察することが可能な電子顕微鏡観察試料の調製方法や、かかる調製方法に用いるための電子顕微鏡観察試料の調製キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の工程(a)~(d)を備えたことを特徴とする電子顕微鏡観察試料の調製方法。
(a)表面を研磨して平滑化し、さらにカーボン又は貴金属の薄膜でコーティングした熱伝導性フィルムを固定器具で固定する工程;
(b)工程(a)で固定した熱伝導性フィルムに細胞を接着させる工程;
(c)工程(b)で細胞を接着させた熱伝導性フィルムを、-150℃以下に冷却した冷却剤に浸漬させて細胞を急速凍結する工程;
(d)工程(c)で急速凍結した細胞から電子顕微鏡観察試料を作製する工程;

【請求項2】
 
カーボン又は貴金属の薄膜が親水処理されていることを特徴とする請求項1記載の電子顕微鏡観察試料の調製方法。

【請求項3】
 
冷却剤が、液体プロパン又は液体イソペンタンであることを特徴とする請求項1又は2記載の電子顕微鏡観察試料の調製方法。

【請求項4】
 
固定器具がOリングであることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の電子顕微鏡観察試料の調製方法。

【請求項5】
 
工程(d)において、工程(c)で急速凍結した細胞を樹脂で包埋し、細胞を包埋した樹脂から熱伝導性フィルムを剥離し、超薄切片を作製することを特徴とする請求項1~4のいずれか記載の電子顕微鏡観察試料の調製方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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