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METHODS AND KITS FOR INCREASING EXPRESSION OF TARGET GENE IN MAMMALIAN CELL, AND USES THEREOF UPDATE_EN

Patent code P170013656
File No. 14105
Posted date Jan 25, 2017
Application number P2015-092336
Publication number P2016-208845A
Patent number P6544565
Date of filing Apr 28, 2015
Date of publication of application Dec 15, 2016
Date of registration Jun 28, 2019
Inventor
  • (In Japanese)清水 典明
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人広島大学
Title METHODS AND KITS FOR INCREASING EXPRESSION OF TARGET GENE IN MAMMALIAN CELL, AND USES THEREOF UPDATE_EN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide methods and kits for increasing the expression of a target gene in a mammalian cell, and to provide uses thereof.
SOLUTION: By simultaneously introducing into a mammalian cell a repeat sequence containing a plurality of polynucleotides which increase the expression of an interest gene, the interest gene, and an expression vector having a polynucleotide encoding a nuclear-matrix binding region which functions within a mammalian cell, the expression of the interest gene within the mammalian cell can be increased.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

本発明者は、複製開始領域(IR;Initiation Region)と核マトリックス結合領域(MAR;Matrix Attachment Region)とを具備するベクター(「IR/MARベクター」または「IR/MARプラスミド」と呼ぶ)を細胞(例えば、COLO 320、または、HeLa)に導入し、ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子を利用して安定な形質転換体を選択することによって、(i)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子(換言すれば、目的遺伝子)の細胞内コピー数を増幅できること、および、(ii)目的遺伝子を、IR/MARベクターに対して同一の遺伝子構築物(シス)として細胞へ導入した場合であっても、IR/MARベクターに対して別の遺伝子構築物(トランス)として細胞へ導入した場合であっても、目的遺伝子の細胞内コピー数を増幅できること、を見出した。そして、本発明者は、上記IR/MARベクターを用いて目的遺伝子を高度に増幅する系(「高度遺伝子増幅系」または「IR/MAR遺伝子増幅系」と呼ぶ)を完成させるに至った(例えば、特許文献1および2、並びに、非特許文献1および2参照)。ここで、高度遺伝子増幅系(IR/MAR遺伝子増幅系)を用いた遺伝子増幅法を、「IR/MAR遺伝子増幅法」と呼ぶ。

IR/MAR遺伝子増幅法によって遺伝子増幅を行った場合、増幅した領域には、目的遺伝子の単純反復配列が形成される。一般的に、反復配列は、頻繁にRepeat-Induced Gene Silencing(RIGS)と呼ばれる現象によって、ヘテロクロマチン化が起こり、転写抑制されることが知られている。また反復配列はRNAi系を高効率的に活性化し、DNAのメチル化を誘導することも知られている。このため、IR/MAR遺伝子増幅法によって増幅した遺伝子は、コピー数とその発現量とが必ずしも比例しない場合があった(例えば、非特許文献3参照)。現在、このような転写抑制を解除する方法の開発が進められつつある。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、
上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、方法:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。

【請求項2】
 
上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものである、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものである、請求項1に記載の方法。

【請求項4】
 
上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか1つに由来する、請求項1~3の何れか1項に記載の方法。

【請求項5】
 
上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものである、請求項1~4の何れか1項に記載の方法。

【請求項6】
 
哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備え、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、キット:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。

【請求項7】
 
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞であって、
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、哺乳動物細胞:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。

【請求項8】
 
請求項7に記載の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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