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(In Japanese)糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法 commons meetings

Patent code P170013690
File No. (2012-033,S2013-0214-N0)
Posted date Feb 2, 2017
Application number P2014-548618
Patent number P6341571
Date of filing Nov 21, 2013
Date of registration May 25, 2018
International application number JP2013081422
International publication number WO2014080991
Date of international filing Nov 21, 2013
Date of international publication May 30, 2014
Priority data
  • P2012-255631 (Nov 21, 2012) JP
  • P2013-108153 (May 22, 2013) JP
Inventor
  • (In Japanese)伊藤 和央
Applicant
  • (In Japanese)公立大学法人大阪市立大学
Title (In Japanese)糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法 commons meetings
Abstract (In Japanese)コンプレックス型糖鎖に作用し、糖タンパク質そのものから糖鎖を直接遊離させる活性を有する酵素を提供することを課題とする。
ラクトバシラス属およびプレボテラ属から選択される微生物に由来するか、または配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9もしくは配列番号11のアミノ酸配列またはこれらの配列のいずれか一つと少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素により上記課題を解決する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

糖鎖は、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)に次ぐ第3のバイオポリマーと呼ばれる生体情報分子である。ヒトにおいて、糖鎖はブドウ糖などの約10種類の単糖から構成される樹状分子であり、そのほとんどがタンパク質に結合した糖タンパク質および脂質に結合した糖脂質として存在する。糖鎖は、分泌タンパク質として体液中に存在するか、または膜タンパク質もしくは糖脂質として細胞表面を覆っていることが多い。

最近の研究により、より多様な糖鎖の機能が明らかにされている。具体的には、糖鎖は、がん(転移、腫瘍マーカーなど)、免疫(免疫受容体調節、免疫細胞分化、抗体医薬など)、受精、発生・分化(再生医療など)、感染症(インフルエンザ、ピロリ菌、コレラ毒素など)などにおいて、重要な役割を果たすことが明らかとなっている。現在、糖鎖の構造および機能解析をすることにより、がんまたは免疫疾患の診断、予防または治療方法の開発、ドラッグデリバリーシステムの構築など、様々な分野への応用が期待されている。

糖タンパク質に結合した糖鎖の構造および機能解析のためには、糖鎖を遊離することが必要である。
特許文献1は、糖鎖のアルデヒド基と特異的に結合するヒドラジド基を有する物質を用いて、糖タンパク質から糖鎖を遊離する方法を開示する。しかしながら、この方法では、タンパク質部分が分解されてしまう。また、遊離した糖鎖の構造が部分的に変化してしまう。

糖鎖部分およびタンパク質部分のいずれも変化を受けずに糖タンパク質から糖鎖を遊離させる方法として、酵素を用いる方法も知られている。
具体的には、アスパラギン結合型糖鎖を遊離する酵素で、世界的に利用されているエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(以下、単に「エンド」ともいう)として、ストレプトミセス・プリカツス(Streptomyces plicatus)由来のエンドHが挙げられる。しかし、エンドHは、酵母および糸状菌の糖タンパク質の糖鎖に特徴的なハイマンノース型およびハイブリッド型のアスパラギン結合型糖鎖に作用するが、ヒトなどの高等動物の糖タンパク質に特徴的なコンプレックス型糖鎖に作用しない。

最近市販されるようになったムコア・ヒエマリス(Mucor hiemalis)由来のエンドMは、エンドHと同様に、ハイマンノース型およびハイブリッド型糖鎖によく作用する。エンドMは、2本鎖コンプレックス型糖鎖に作用するその性質により、配糖体合成に利用されている。しかし、その作用は、ハイマンノース型に対する作用に比べて低い。また、糖鎖部分とジアセチルキトビオース部分との間にフコースを含む糖タンパク質の糖鎖および3~5本鎖分岐のコンプレックス型糖鎖には作用しにくい。さらに、糖鎖を遊離するためには、タンパク質部分を消化し、糖ペプチドまたは糖アスパラギンとすることが必要である。よって、このエンドMを用いても、糖タンパク質そのものから糖鎖を直接遊離することは難しい。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素およびその製造方法、該酵素を用いる糖鎖の遊離方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号7のアミノ酸配列から膜貫通領域を除去したアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素であって、
前記糖鎖が、前記糖タンパク質のタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基にジアセチルキトビオース部分を介して結合している2~5本鎖分岐のコンプレックス型の糖鎖である、酵素。

【請求項2】
 
前記糖タンパク質が、脊椎動物を含む動物に由来する糖タンパク質である請求項1に記載の酵素。

【請求項3】
 
前記糖タンパク質が、糖鎖部分の根元の糖とジアセチルキトビオース部分との間に、フコースを更に含む請求項1又は2に記載の酵素。

【請求項4】
 
前記糖鎖が、その末端側にシアル酸を含む請求項1~3のいずれか1項に記載の酵素。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれか1項に記載の酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター。

【請求項6】
 
請求項5に記載の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。

【請求項7】
 
請求項6に記載の細胞を培養することにより、培養物を得る工程と、
得られた培養物を精製することにより、請求項1~4のいずれか1項に記載の酵素を得る工程と
を含む酵素の製造方法。

【請求項8】
 
糖タンパク質のタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基にジアセチルキトビオース部分を介して結合している2~5本鎖分岐のコンプレックス型の糖鎖の遊離方法であって、
配列番号1又は配列番号7のアミノ酸配列から膜貫通領域を除去したアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素と、糖タンパク質を含む試料とを接触させることにより、前記糖タンパク質の糖鎖を遊離させる工程を含み、
遊離される前記糖鎖が、前記コンプレックス型の糖鎖である、
方法。

【請求項9】
 
糖タンパク質のタンパク質部分のアスパラギンのアミノ基にジアセチルキトビオース部分を介して結合している2~5本鎖分岐のコンプレックス型の糖鎖の転移方法であって、
配列番号1又は配列番号7のアミノ酸配列から膜貫通領域を除去したアミノ酸配列を有し、かつ、糖タンパク質の糖鎖を遊離させる活性を有する酵素と、糖タンパク質を含む試料とを、糖鎖受容体の存在下で接触させることにより、前記糖タンパク質から遊離させた糖鎖を前記糖鎖受容体に転移させる工程を含み、
遊離及び転移される前記糖鎖が、前記コンプレックス型の糖鎖である、
方法。

【請求項10】
 
請求項6に記載の宿主細胞を含む培養物。

【請求項11】
 
請求項10に記載の培養物の処理物。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered


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