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(In Japanese)RNA干渉剤、その製造方法及びその利用 commons meetings

Patent code P170013692
File No. (GI-H23-45)
Posted date Feb 2, 2017
Application number P2014-549919
Patent number P6346568
Date of filing Nov 29, 2013
Date of registration Jun 1, 2018
International application number JP2013082179
International publication number WO2014084354
Date of international filing Nov 29, 2013
Date of international publication Jun 5, 2014
Priority data
  • P2012-261730 (Nov 29, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)北出 幸夫
  • (In Japanese)中島 礼美
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岐阜大学
Title (In Japanese)RNA干渉剤、その製造方法及びその利用 commons meetings
Abstract (In Japanese)簡易な構成でオフ・ターゲット効果の抑制効果が得られるRNA干渉剤を提供する。このため、本開示は、3’末端にPAZドメイン低親和性ユニットを1又は2以上を備える、一本鎖オリゴヌクレオチドをパッセンジャー鎖として備えるRNA干渉剤とする。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

RNAiは、配列特異的にmRNAの分解を生じさせ、ターゲットとなる遺伝子の発現を抑制することができる。RNAiを引き起こすsiRNAやmiRNAは、技術としての簡便性及びその高い遺伝子抑制効果の観点から、遺伝子の機能解析や臨床応用が期待されている。

RNAi経路では、通常、細胞内で二本鎖siRNA又はmiRNAがRISCと呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、一本鎖に解離する。そのままRISC中に残されて遺伝子発現に関与する鎖をガイド鎖(アンチセンス鎖)といい、他方、RISCから放出される他方の鎖をパッセンジャー鎖(センス鎖)という。siRNAの場合には、ガイド鎖が正しくRISCに取り込まれると、ガイド鎖を含むRISC複合体は、ガイド鎖と相補的な配列を有するターゲットmRNAを認識し、ago2のスライサー活性によって標的mRNAを切断する。また、miRNAの場合には、標的mRNAを認識し、翻訳過程を抑制する。こうした結果、ターゲット遺伝子の発現が抑制されると考えられている。

RISCがこれら二本鎖のうちどのような機構で一方の鎖をガイド鎖として認識するかについては、二本鎖両末端の熱力学的安定性に起因すると推測されている。

ここで、パッセンジャー鎖があたかもガイド鎖のように取り込まれうる場合もある。こうした場合には、いわゆるオフ・ターゲット効果が生じてしまう。オフ・ターゲット効果とは、ターゲット遺伝子以外の本来意図していない他の遺伝子を抑制してしまう現象をいう。RNAiにおいては、パッセンジャー鎖がRISCに取り込まれることで、パッセンジャー鎖の有する塩基配列(ガイド鎖と相補的である)が本来のターゲット遺伝子でない他の遺伝子のmRNAに対して作用して、その発現を抑制してしまうことが生じうる。

こうしたオフ・ターゲット効果を抑制するための試みとして、パッセンジャー鎖に修飾ヌクレオチドを導入することが開示されている(特許文献1)。また、パッセンジャー鎖に不連続部位を設けることが開示されている(特許文献2)。さらに、センス鎖(パッセンジャー鎖)の一又は両方の末端のヌクレオチドの2’位の水酸基にメチル基等で修飾することで、アンチセンス鎖(ガイド鎖)の取り込をRISCへの取り込みを促進することなどが開示されている(特許文献3)。

また、RISCのPAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)ドメインは、普遍的に疎水性ポケットを有することがわかっており、この疎水性ポケットにガイド鎖の3’-末端が相互作用することでガイド鎖-RISC複合体が形成されることがわかっている(非特許文献1)。

Field of industrial application (In Japanese)

本明細書は、RNA干渉(以下、単に、RNAiともいう。)剤、その製造方法及びその利用等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
3’末端にPAZドメイン高親和性ユニットを備え、標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
3’末端に、以下の式(1)で表されるPAZドメイン低親和性ユニットを備え、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズするパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備える、RNA干渉剤。
【化1】
 
(省略)
(ただし、Xは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Yは、炭素数が2又は3のアルキレン基を表し、nは2以上の整数を表す。)

【請求項2】
 
前記式(1)は、以下の式で表される、請求項1に記載のRNA干渉剤。
【化2】
 
(省略)

【請求項3】
 
前記式(1)において、nは2である、請求項1又は2に記載のRNA干渉剤。

【請求項4】
 
前記式(1)において、Yが炭素数2のアルキレン基である、請求項3に記載のRNA干渉剤。

【請求項5】
 
前記PAZドメイン高親和性ユニットは、以下の式で表される、請求項1~4のいずれかに記載のRNA干渉剤。
【化3】
 
(省略)
[式中、Aは独立して以下のいずれかの式を表し、mは1又は2以上の整数を表す。]
【化4】
 
(省略)

【請求項6】
 
前記PAZドメイン高親和性ユニットは、TTと同等あるいはそれ以上PAZドメインより親和性が高く、前記PAZドメイン低親和性ユニットは、TTよりもPAZドメイン親和性が低い、請求項1~5のいずれかに記載のRNA干渉剤。

【請求項7】
 
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、3’末端に、PAZドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、
前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、3’末端にPAZドメイン低親和性ユニットを1又は2以上有するパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、
を備え、
前記PAZドメイン高親和性ユニットは、TTと同等あるいはそれ以上PAZドメインより親和性が高く、前記PAZドメイン低親和性ユニットは、TTよりもPAZドメイン親和性が低く、
前記PAZドメイン低親和性ユニットは酸性基、塩基性基、水酸基、エーテル結合から選択される極性基を含み、前記PAZドメイン高親和性ユニットよりも極性が高い、RNA干渉剤。

【請求項8】
 
前記酸性基は、カルボキシ基及びリン酸基から選択され、前記塩基性基は、アミノ基から選択される、請求項7に記載のRNA干渉剤。

【請求項9】
 
RNA干渉剤の製造方法であって、
標的遺伝子の所定の塩基配列に対するアンチセンス部位を有し、3’末端に、PAZドメイン高親和性ユニットを有するガイド鎖オリゴヌクレオチドと、前記アンチセンス部位に特異的にハイブリダイズし、3’末端に、以下の式(1)で表されるPAZドメイン低親和性ユニットを1又は2以上をパッセンジャー鎖オリゴヌクレオチドと、を準備し、ハイブリダイゼーションにより二重鎖RNAを形成する工程、
を備える、方法。
【化5】
 
(省略)
(ただし、Xは、酸性基又は塩基性基又はこれらを有する連結基であり、Yは、炭素数が2又は3のアルキレン基を表し、nは2以上の整数を表す。)

【請求項10】
 
遺伝子の機能の評価方法であって、
前記遺伝子を標的遺伝子として、請求項1~8のいずれかに記載のRNA干渉剤を準備する工程と、
前記遺伝子を保持する細胞に前記RNA干渉剤を導入して、前記細胞における変化を評価する工程、
を備える、評価方法。

【請求項11】
 
RNA干渉剤のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子の1又は2以上の異なる所定の塩基配列に対するアンチセンス部位候補をそれぞれ有する1又は2以上の請求項1~8のいずれかに記載のRNA干渉剤を準備する工程と、
前記1又は2以上のRNA干渉剤を前記標的遺伝子を保持する細胞に導入して前記細胞における前記標的遺伝子の発現状態を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2014549919thum.jpg
State of application right Registered
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