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(In Japanese)結晶化促進ポリペプチド

Patent code P170013840
File No. (S2013-0936-N0)
Posted date Mar 16, 2017
Application number P2015-515878
Patent number P6399707
Date of filing May 7, 2014
Date of registration Sep 14, 2018
International application number JP2014062215
International publication number WO2014181786
Date of international filing May 7, 2014
Date of international publication Nov 13, 2014
Priority data
  • P2013-097698 (May 7, 2013) JP
Inventor
  • (In Japanese)姚 閔
  • (In Japanese)薦田 圭介
  • (In Japanese)于 健
  • (In Japanese)田中 良和
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北海道大学
Title (In Japanese)結晶化促進ポリペプチド
Abstract (In Japanese)本発明の目的は、X線結晶構造解析法において、目的のタンパク質の結晶化を促進するための、汎用性があり、かつ効率的な方法を提供することである。
前記課題は、(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、N末側から1~18個のアミノ酸が欠失、及び/若しくはC末側から1~3個のいずれかのアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチド、によって解決することができる。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


タンパク質の構造解析にはX線結晶構造解析法、NMR法、又は電子顕微鏡による解析が主に使用されている。その中で、X線結晶構造解析法は、電子顕微鏡よりも精度の高い分子像が得られる。また、NMR法と比べて分子量が大きな分子においても適用可能である。従って、X線結晶構造解析法は、タンパク質の構造解析法として、汎用されている。しかし、X線結晶構造解析法によるタンパク質の分析のためには、タンパク質を結晶化する必要がある。単分子のタンパク質は、X線散乱が弱く強度が低いため、構造を解析することができない。タンパク質の結晶では、回折光が増幅されるため、散乱強度を測定することができ、それにより電子密度を計算することによって、タンパク質分子の構造モデルを作製することが可能となる。



しかしながら、タンパク質の結晶化はX線結晶構造解析法でも一番の難関である。タンパク質の結晶化条件は、例えば同じファミリーに属するタンパク質同士でも大きく異なり、pHや沈殿剤濃度の変化に非常に敏感である。また、タンパク質の結晶化のメカニズムは現在でも明らかになっていない。そのため、タンパク質の結晶化には、大量の条件検討を行う必要があり、多大な労力、時間、及び費用がかかる。そして、X線結晶構造解析法においては、良質の結晶が得られないために、構造解析ができないタンパク質も多い。
X線結晶構造解析法に用いるタンパク質結晶を得るために、多数の結晶化条件を検討するための結晶化キットが開発され、また結晶化ロボットを用いる条件検討が行われている。更に、無重力場(宇宙空間)での結晶化、磁場又はレーザー照射による結晶化などが検討されているが、いずれも十分な効果を挙げているとは言いがたいものであった。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、タンパク質の結晶化を促進することのできるポリペプチド及びタンパク質の結晶化方法に関する。本発明によれば、X線結晶構造解析法に用いるためのタンパク質結晶を容易に得ることができる。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又
2)前記ポリペプチド(1)のアミノ酸配列において、1~3のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンパク質のC末端若しくはN末端に直接若しくはペプチドリンカーを介して融合させた融合タンパク質として発現させた場合に当該融合タンパク質の結晶化を促進する活性を示す、改変体ポリペプチド。

【請求項2】
 
前記改変体ポリペプチドが、配列番号3、又は4で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。

【請求項3】
 
請求項1又は2に記載のポリペプチドが、タンパク質のC末端又はN末端に、直接又はペプチドリンカーを介して融合した、融合タンパク質。

【請求項4】
 
請求項1又は2に記載のポリペプチド又は請求項3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項5】
 
請求項4に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。

【請求項6】
 
請求項5に記載の組換えベクターを含む形質転換細胞。

【請求項7】
 
請求項3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、及び
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、
を含む融合タンパク質の製造方法。

【請求項8】
 
請求項3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、及び
精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、
を含む請求項7に記載の融合タンパク質の製造方法。

【請求項9】
 
請求項3に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターを構築する工程、
前記組換えベクターを用いて融合タンパク質を発現させる工程、
前記発現した融合タンパク質を精製する工程、
精製された融合タンパク質の多量体形成を確認する工程、
精製された融合タンパク質を結晶化させる工程、及び
X線照射によりタンパク質結晶を確認する工程、
を含むタンパク質結晶の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2015515878thum.jpg
State of application right Registered
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