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VITRIFIED STATE STABILIZER FOR ANIMAL CELL CRYOPRESERVATION LIQUID

Patent code P170014038
File No. (S2015-1530-N0)
Posted date Apr 11, 2017
Application number P2016-023010
Publication number P2016-220672A
Patent number P6678931
Date of filing Feb 9, 2016
Date of publication of application Dec 28, 2016
Date of registration Mar 23, 2020
Priority data
  • P2015-110473 (May 29, 2015) JP
Inventor
  • (In Japanese)松村 和明
  • (In Japanese)鈴木 雅
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
Title VITRIFIED STATE STABILIZER FOR ANIMAL CELL CRYOPRESERVATION LIQUID
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide animal cell cryopreservation liquid having excellent vitrifying capability.
SOLUTION: There are provided a vitrified state stabilizer for animal cell cryopreservation liquid which contains amphoteric polymer compound selected from a group consisting of: (a) a carboxylated amphoteric polymer compound produced by allowing ε-poly-L-lysine to react with butyl succinic anhydride; (b) a carboxylated amphoteric polymer compound produced by allowing ε-poly-L-lysine to react with butyl succinic anhydride and succinic anhydride; or (c) a carboxylated amphoteric polymer compound produced by allowing ε-poly-L-lysine to react with a compound expressed in Formula I, and animal cell cryopreservation liquid containing the vitrified state stabilizer.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、再生医療の臨床応用への期待が高まっている。このための基本技術として、細胞、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織を、凍結保存する技術が必要とされている。このような技術として、凍結保護物質を添加して、対象の損傷を防ぎつつ、凍結保存する技術がある。このような凍結保護物質として、ジメチルスルホキシド(DMSO)(O=S(CH32)、グリセリンなどが知られている。

DMSOやグリセリンは、分散した細胞に対する凍結保存での使用には、十分な実績がある。しかし、DMSOやグリセリンは、細胞シート、三次元形状の細胞構造体、組織などに対する凍結保存での使用では、解凍後にしばしば損傷した状態を生じて、ダメージを残してしまう。この損傷が、凍結時の氷晶形成や脱水収縮から生じるのではないかと考えて、氷の結晶化を制御して、アモルフォスの状態のままで固化させる、ガラス化法が、試みられている。

ガラス化法は、受精卵の凍結手法として発展してきたものであり、従来のガラス化法は、一般に、急速な凍結速度と濃い溶質濃度によって、水溶液をガラス化させることを意図している。例えば、マウスの受精卵のガラス化溶液として、DAP213が知られている。DAP213は、DMSO 2M、アセトアミド 1M、プロピレングリコール 3Mの溶液であり、濃度が高く、毒性も高くなっている。典型的な使用法は、マウスの受精卵に含有されている水を、この溶液で置換し、液体窒素に直接浸漬して、ガラス化状態を得る手法である。しかし、このようなガラス化溶液によるガラス化では、細胞毒性が高く、さらに解凍時の再結晶化によるダメージも高いとされている。

そこで、本発明者らは、凍結保護物質を検討して、ガラス化法を改良することを試みてきた(特許文献1)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤、及び該ガラス化状態安定化剤を含有する動物細胞凍結保存液に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の(c)の、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物を含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤:
(c) ε-ポリ-L-リジンを、次の式II:
【化2】
 
(省略)
(ただし、上記の式中、
R1及びR2は、メチル基である)
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。

【請求項2】
 
両性高分子化合物において、ε-ポリ-L-リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、50%~75%の範囲にある、請求項1に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。

【請求項3】
 
請求項1~2のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。

【請求項4】
 
請求項1~2のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を、2~40重量%で含有し、
エチレングリコール又はプロピレングリコールを、3~8Mの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。

【請求項5】
 
さらに、スクロースを、0.1~1Mの濃度で含有する、請求項4に記載の動物細胞凍結保存液。

【請求項6】
 
動物細胞凍結保存液が、動物細胞ガラス化状態凍結保存液である、請求項3~5のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。

【請求項7】
 
請求項3~6のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
を含む、動物細胞凍結保存方法。

【請求項8】
 
動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
を含む、請求項7に記載の動物細胞凍結保存方法。

【請求項9】
 
動物細胞を、降温して凍結する工程が、
動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、請求項7~8のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。

【請求項10】
 
動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、請求項8~9のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。

【請求項11】
 
降温して凍結する工程が、
降温速度5℃/分~50℃/分で降温して凍結する工程、である、請求項7~10のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。

【請求項12】
 
昇温して解凍する工程が、
昇温速度5℃/分~100℃/分で昇温して解凍する工程、である、請求項8~11のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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