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自己組織化用細胞集合体の作製方法

国内特許コード P170014082
整理番号 (S2014-0574-N0)
掲載日 2017年5月9日
出願番号 特願2016-505305
登録番号 特許第6489484号
出願日 平成27年2月26日(2015.2.26)
登録日 平成31年3月8日(2019.3.8)
国際出願番号 JP2015055695
国際公開番号 WO2015129822
国際出願日 平成27年2月26日(2015.2.26)
国際公開日 平成27年9月3日(2015.9.3)
優先権データ
  • 特願2014-037341 (2014.2.27) JP
発明者
  • 武部 貴則
  • 谷口 英樹
  • 吉川 洋史
出願人
  • 公立大学法人横浜市立大学
  • 国立大学法人埼玉大学
発明の名称 自己組織化用細胞集合体の作製方法
発明の概要 in vitroにおいて多数の細胞(数万~数百万個)から細胞集合体の作製に必要となる要件を発見するとともに、肝臓や腎臓などの複雑な高次構造や、他の臓器との相互作用を実現することの可能な自己組織化用細胞集合体の形成方法を提供する。
総細胞数として40万個以上の任意の種類の細胞及び/又は組織と10万~40万個の間葉系細胞との混合物を培養し、大きさが1mm以上である細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をin vitroで作製する方法。前記方法で作製された細胞集合体。前記方法で作製された細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させることを含む、三次元組織構造の作製方法。培養する側の断面がU又はV字の形状であるゲル状培養支持体。
従来技術、競合技術の概要

近年、複雑な構造を有する組織・臓器を形成する方法として、細胞が本来有する自己組織化能(Self-Organization)を利用する方法が注目されている(非特許文献1,2)。自己組織化とは、1種類あるいは少数の種類の要素が、外部から特別の「指示」となる情報を受けることなく、自分たちの内在的な特性を発揮して複雑な高次の構造を組み上げて行くことである。例えば、雪の結晶形成などのように、パターンのない集合体の中で、自発的な秩序が生まれてパターンが形成されて行く自然現象が観察されるほか、ナノテクノロジーや光学結晶の作製などで工学的にも利用されている。

自己組織化を誘導するための要件としては、高密度環境で均一な細胞からなる集合体(Aggregate)を形成することが必要となる。培養を行ったES・iPS細胞からAggregateを作成し、脳、眼杯、下垂体、歯などを作製することが報告されている(非特許文献3-6)。このような、Aggregateを作製するための手法としては、底面がUやV状の構造を持つ96wellなどのように底面に集まるような基材を用いることにより、少数の細胞(数千個程度)の細胞集合体から数百μmレベルの組織を形成する方法が主として用いられている。しかし、多数の細胞(数万~数百万個)からより大型(200μm以上~)の細胞集合体を形成することは達成困難であった。このために、さまざまな種類の細胞からなるAggregateを作製するためには従来の方法を適応することは困難であった。

したがって、マウスなどの小型動物の組織・臓器と比較して、自己組織化を利用してヒトなどのように大型の複雑な組織・臓器を作製するための集合体を作製する手法の開発が望まれていた。

産業上の利用分野

本発明は、自己組織化用細胞集合体の作製方法に関し、より詳細には、目的とする組織・臓器への自己組織化を誘導するために必要な細胞集合体の作製方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
任意の種類の細胞及び/又は組織から細胞集合体を形成するための剤であって、
前記剤は、有効成分として未分化間葉系細胞を含み、
前記細胞集合体は、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成できるものである前記の剤

【請求項2】
任意の種類の細胞及び/又は組織と前記剤との混合物を未分化間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体の上で培養する請求項1記載の

【請求項3】
ゲル状支持体のヤング率が200kPa以下である請求項2記載の剤

【請求項4】
ゲル状支持体のヤング率が100kPa以下である請求項3記載の剤

【請求項5】
ゲル状支持体が、マトリゲル、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、フィブロネクチン及びビトロネクチンからなる群より選択される少なくとも1つの物質によりコーティングされている請求項2~4のいずれかに記載の剤

【請求項6】
培養が二次元培養である請求項2~5のいずれかに記載の

【請求項7】
ゲル状支持体が平面であるか、あるいは、ゲル状支持体の培養する側の断面がU又はV字の形状である請求項2~6のいずれかに記載の

【請求項8】
ゲル状支持体の中心部の硬さが周辺部の硬さより固い請求項のいずれかに記載の

【請求項9】
ゲル状支持体の周辺部の硬さが中心部の硬さより固い請求項のいずれかに記載の

【請求項10】
ゲル状支持体がパターン化されており、中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを1個以上有する請求項のいずれかに記載の

【請求項11】
ゲル状支持体がパターン化されており、周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを1個以上有する請求項のいずれかに記載の

【請求項12】
任意の種類の細胞及び/又は組織が総細胞数として40万個以上であり、間葉系細胞が10万~40万個である請求項1~11のいずれかに記載の

【請求項13】
細胞集合体の大きさが1mm以上である請求項1~12のいずれかに記載の

【請求項14】
細胞集合体の形成が自律的なものである請求項1~13のいずれかに記載の

【請求項15】
足場材料を用いることなく、任意の種類の細胞及び/又は組織と間葉系細胞との混合物を培養する請求項1~14のいずれかに記載の

【請求項16】
任意の種類の細胞及び/又は組織が、肝臓、膵臓、腸、肺、腎臓、心臓、脳又は癌に由来する請求項1~15のいずれかに記載の

【請求項17】
任意の種類の細胞が、多能性細胞である請求項1~15のいずれかに記載の

【請求項18】
任意の種類の組織が、多能性細胞より誘導された組織である請求項1~15のいずれかに記載の

【請求項19】
多能性細胞が、生体より得られた多能性細胞、再プログラムから誘導して得られた多能性細胞、又はそれらの組み合わせである請求項17又は18記載の

【請求項20】
細胞集合体を自己組織化させ、高次構造が付加された三次元組織構造を形成させる請求項1~19のいずれかに記載の剤

【請求項21】
培養する側の断面がU又はV字の形状であるゲル状培養支持体と請求項1~20のいずれかに記載の剤とを含む、細胞集合体形成のためのキット

【請求項22】
中心部の硬さが周辺部の硬さより固いゲル状培養支持体と請求項1~20のいずれかに記載の剤とを含む、細胞集合体形成のためのキット

【請求項23】
周辺部の硬さが中心部の硬さより固いゲル状培養支持体と請求項1~20のいずれかに記載の剤とを含む、細胞集合体形成のためのキット

【請求項24】
中心部の硬さが周辺部の硬さより固いというパターンを1個以上有するゲル状培養支持体と請求項1~20のいずれかに記載の剤とを含む、細胞集合体形成のためのキット

【請求項25】
周辺部の硬さが中心部の硬さより固いというパターンを1個以上有するゲル状培養支持体と請求項1~20のいずれかに記載の剤とを含む、細胞集合体形成のためのキット

【請求項26】
任意の1種類の細胞のみと未分化間葉系細胞との混合物を培養し、細胞集合体を形成させることを含む、細胞集合体をin vitroで作製する方法であって、前記細胞集合体は、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成できるものである前記方法。

【請求項27】
任意の1種類の細胞のみと未分化間葉系細胞との混合物を未分化間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体の上で培養する請求項26記載の方法。

【請求項28】
任意の種類の組織と未分化間葉系細胞との混合物を培養し、組織と細胞の集合体を形成させることを含む、組織と細胞の集合体をin vitroで作製する方法であって、前記集合体は、自己組織化により、高次構造が付加された三次元組織構造を形成できるものである前記方法。

【請求項29】
任意の種類の組織と未分化間葉系細胞との混合物を未分化間葉系細胞が収縮可能なゲル状支持体の上で培養する請求項28記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 登録
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