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(In Japanese)細胞播種培養装置 meetings

Patent code P170014254
File No. (AF19-09WO)
Posted date Jun 23, 2017
Application number P2015-559147
Patent number P6624933
Date of filing Jan 23, 2015
Date of registration Dec 6, 2019
International application number JP2015051905
International publication number WO2015111722
Date of international filing Jan 23, 2015
Date of international publication Jul 30, 2015
Priority data
  • P2014-011640 (Jan 24, 2014) JP
Inventor
  • (In Japanese)宇理須 恒雄
  • (In Japanese)ワン,ツーホン
  • (In Japanese)宇野 秀隆
  • (In Japanese)長岡 靖崇
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)細胞播種培養装置 meetings
Abstract (In Japanese)細胞を簡便且つ短時間で複数の細胞配置領域に播種する装置を提供する。複数の突起部により包囲された細胞配置領域(8)を複数有する細胞培養基板(2)と、当該細胞培養基板(2)上に配置された、複数の貫通孔(14)を有する流路基板(3)とを含む神経ネットワークを形成可能な細胞の播種培養装置(1)において、各貫通孔(14)が、基板上面側を入口(15)、基板下面側を出口とする流路を規定し、各流路の出口(16)が、いずれかの細胞配置領域上に位置するように構成することによる。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、細胞間ネットワークについての研究が活発になされてきており、細胞間のネットワークをin vitroで構成しようとする提案がなされている。in vitroで構成された細胞ネットワークは、イメージング研究やパッチクランプ法による電気生理学的研究に有用である。細胞間ネットワークをin vitroで構成するためには、細胞を所定の位置に配置して培養を行うことが必要である。例えば、非特許文献1では、トランジスターを配置したシリコン基板上に複数の突起部で囲まれた領域を設け、ここに巻き貝(stagnalis)の末梢神経細胞集合体である大きな神経節(ganglion)を配置して、神経細胞の電位を検出する実験を行っている。また非特許文献2では、基板上に「ケージ」と称する略円盤形の囲い(高さ約9μm)を複数形成し、各ケージの中央部のスペースに神経細胞を配置すると共に、ケージに設けた幾つかのトンネルを通じて神経細胞の軸索などを隣接のケージ中の神経細胞に向かって伸張させるニューロチップを開示している。しかしながら、非特許文献1及び2は、多数の細胞定着部に効率的に神経細胞を播種するための神経細胞播種システムを開示しない。通常のピペットや計量機能付きのピペット、或いはマイクロインジェクターなどの器具を用いて、手作業により個々の細胞配置領域に細胞を播種するという方法は、極めて微小な細胞配置領域に正確に播種することが困難であり、播種効率が劣るため好ましくない。

一方で、パッチクランプ法は、細胞間のシグナルの伝達を、膜電位や膜電流を計測する電気生理学的手法であり、通常ピペットを用いたパッチクランプ法が行われている。しかしながら、ピペットパッチクランプ法では、個々の細胞をピペットで細胞を捕捉(クランプ)して、電気的変化を測定する手法であるため、多点計測によるハイスループットスクリーニングに応用できなかった。パッチクランプ法をハイスループットスクリーニングに用いることを目的として、本発明者等は、プレーナーパッチクランプ法を開発している(特許文献1及び2)。このプレーナーパッチクランプ法では、電気絶縁性の基板上に複数の微細な貫通孔を設け、かかる貫通孔上に配置された細胞における電気的変化、例えば膜電位又は膜電流を計測する手法であり、多点計測によるハイスループットスクリーニングが可能になる。しかしながら、in vitroで細胞間のネットワークを構成するために、細胞を多数の細胞定着部に細胞を播種する方法が困難であるのと同様に、電気絶縁性の基板の複数の貫通孔上に正確に細胞を配置する方法も依然として困難であった。

したがって、細胞ネットワークをin vitroで構成するため、さらにはプレーナーパッチクランプ法により電気的性質を研究するためには、細胞を所定の配置領域に正確かつ迅速に配置することが要求されている。

所定の細胞配置領域に細胞を播種する技術としては、ピペットを利用した方法の他、インクジェットプリンターの原理を利用して、ピペットによる播種方法を機械的に自動化した細胞播種方法も開発されている(特許文献3)。また、別の細胞播種技術としては、マイクロ流路を用いて、所定の凹部に細胞を運び、その凹部が細胞で満たされると、次の凹部に細胞が運ばれることにより、順次細胞配置領域である凹部が細胞で埋められていくという原理で細胞を播種する技術が行われている(非特許文献3)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、複数の細胞配置領域に対して、細胞を配置することを可能にする細胞播種培養装置に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞の移動及び流失を妨げる複数の突起部により包囲された細胞配置領域を複数有し、
突起部により規定される細胞配置領域が、1~数個の細胞を収容できるサイズであり、神経ネットワーク形成可能な細胞の培養基板と、当該培養基板上に配置された、細胞の通過を許容する複数の貫通孔を有する流路基板とを含む神経ネットワーク形成可能な細胞の播種培養装置であって、各貫通孔が、基板上面側を入口、基板下面側を出口とし、該入口から該出口にかけて縮小する細胞播種のための流路を規定し、各流路の出口が、いずれかの細胞配置領域上に位置し、該出口の大きさが細胞配置領域よりも小さく、該培養基板と該流路基板との間に突起部の高さより厚いスペーサー部材を配置し、スペーサー部材の厚さに対応する、細胞配置領域間で神経ネットワークを形成可能な空隙を形成し、前記出口と前記突起部との間に、細胞が流出する隙間が存在せず、ここで播種時に該空隙が液体で満たされる、前記細胞播種培養装置。

【請求項2】
 
前記入口から出口にかけて縮小する細胞播種のための流路が、漏斗形状である、請求項1に記載の細胞播種培養装置。

【請求項3】
 
前記細胞播種のための流路の入口が100~500μmであり、出口が20~50μmであり、及び前記流路基板の厚さが、0.2mm~5mmである、請求項1又は2に記載の細胞播種培養装置。

【請求項4】
 
前記細胞の移動及び流失を妨げる複数の突起部から構成される細胞保持部の内径が、10~25μmである、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項5】
 
前記突起部の高さが、5~15μmである、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項6】
 
前記細胞播種培養装置が、1の細胞配置領域あたり、1~数個の細胞の配置を可能にする、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項7】
 
前記流路基板が、細胞定着後に培養基板から取り外し可能に配置されており、流路基板が取り外された培養基板が実験に供される、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項8】
 
前記流路基板の上面に、貯液部を規定する貯液基板をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項9】
 
前記培養基板が、プレーナーパッチクランプに用いる電気絶縁性基板であり、細胞配置領域内に、細胞を通過させないが電通を達成しうるプレーナーパッチクランプ用貫通孔を有する、請求項1~8のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項10】
 
前記培養基板が、神経ネットワークのイメージング用基板である、請求項1~9のいずれか一項に記載の細胞播種培養装置。

【請求項11】
 
細胞の移動及び流失を妨げる複数の高さ5~15μmの突起部により包囲された内径10~25μmの細胞配置領域を複数有する、神経ネットワーク形成可能な細胞の培養基板と、当該培養基板上に配置された、細胞の通過を許容する複数の貫通孔を有し、0.2mm~5mmの厚さを有する流路基板とを含む神経ネットワーク形成可能な細胞の播種培養装置であって、各貫通孔が、基板上面側に100~500μmの入口、基板下面側に20~50μmの出口を有し、入口から出口にかけて縮小しており、各流路の出口が、いずれかの細胞配置領域上に位置し、培養基板と流路基板との間にスペーサー部材が存在し、スペーサー部材の厚さに対応する、細胞配置領域間で神経ネットワークを形成可能な空隙を形成し、そして播種時に該空隙が液体で満たされ、前記出口と前記突起部との間に、細胞が流出する隙間が存在しない、前記播種培養装置。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2015559147thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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