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(In Japanese)カルシウム指示遺伝子

Patent code P170014264
File No. (AF25P001)
Posted date Jun 23, 2017
Application number P2016-527634
Patent number P6462684
Date of filing Jun 8, 2015
Date of registration Jan 11, 2019
International application number JP2015002869
International publication number WO2015190083
Date of international filing Jun 8, 2015
Date of international publication Dec 17, 2015
Priority data
  • P2014-120828 (Jun 11, 2014) JP
Inventor
  • (In Japanese)尾藤 晴彦
  • (In Japanese)井上 昌俊
  • (In Japanese)竹内 敦也
  • (In Japanese)中井 淳一
  • (In Japanese)大倉 正道
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)カルシウム指示遺伝子
Abstract (In Japanese)蛍光特性及びカルシウム反応性に優れるカルシウム指示タンパクとして、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているDNAを提供する。このDNAによってコードされるカルシウム指示タンパクは、カルシウムが結合したCaM配列に対する結合ドメインとしてckkap配列を有することにより、従来のカルシウム指示タンパクに比して優れた蛍光特性及びカルシウム反応性を発揮する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

カルシウムは、筋肉の収縮、神経興奮性やホルモン分泌、酵素活性の変化などの各種の細胞機能の調節因子として、生体機能の維持および調節に不可欠な役割を担っている。生体内(細胞外及び細胞内)のカルシウム濃度を測定するため、従来、カルシウムセンサー(カルシウムインディケーター)と称されるタンパクが用いられている。

近年、脳高次機能の本質である認知活動を細胞レベル及び細胞内ドメインレベルで解析するため、神経活動に伴うカルシウム濃度の変化を超高速でイメージングする技術が必要とされており、優れたカルシウム反応性を備える蛍光カルシウムセンサーの開発が望まれている。

カルシウムセンサーとして機能するタンパクとして、蛍光タンパクにカルモジュリンの部分配列とミオシン軽鎖キナーゼの部分配列を結合したカルシウム指示タンパクが知られている。このカルシウム指示タンパクは、カルシウムがカルモジュリンの部分配列に結合するとタンパクの立体構造が変化し、蛍光タンパク(GFP又はRFP)の発する蛍光強度が変化することを利用している。例えば、非特許文献1には、蛍光タンパクとしてmAppleを用いたカルシウム指示タンパク(R-GECO1)が記載されている。また、特許文献1には、R-GECO1を改良して作成され、R-GECO1よりも大きな蛍光強度変化を示すR-CaMP1.01と、R-CaMP1.01を改良して作成され、R-CaMP1.01よりもさらに大きな蛍光強度変化を示し、細胞内の局在性が改善されたR-CaMP1.07が開示されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、カルシウム指示遺伝子に関する。より詳しくは、カルシウムセンサーとして機能する蛍光タンパクであって、蛍光特性及びカルシウム反応性に優れた蛍光カルシウム指示タンパクに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているDNAであり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、DNA。

【請求項2】
 
ckkap配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチド、及び、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとCaM配列をコードするヌクレオチドが、アミノ酸リンカーをコードするヌクレオチドを介してそれぞれ結合されている、請求項1記載のDNA。

【請求項3】
 
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端にckkap配列をコードするヌクレオチドが、3’末端側にCaM配列をコードするヌクレオチドが結合されており、
ckkap配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーAをコードするヌクレオチドを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとCaM配列をコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーBをコードするヌクレオチドを介して結合されており、
アミノ酸リンカーA及びアミノ酸リンカーBの組み合わせが、アミノ酸リンカーA(-Pro-Val-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Arg)である、請求項2記載のDNA

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。

【請求項5】
 
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された形質転換細胞であり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、形質転換細胞。

【請求項6】
 
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された、ヒトを除くトランスジェニック動物であり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、トランスジェニック動物。

【請求項7】
 
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)が蛍光タンパクのN末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されているタンパクであり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、タンパク。

【請求項8】
 
ckkap配列と蛍光タンパク、及び、蛍光タンパクとCaM配列が、アミノ酸リンカーを介してそれぞれ結合されている、請求項7記載のタンパク。

【請求項9】
 
蛍光タンパクのN末端にckkap配列が、C末端側にCaM配列が結合されており、
ckkap配列と蛍光タンパクがアミノ酸リンカーAを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクとCaM配列がアミノ酸リンカーBを介して結合されており、
アミノ酸リンカーA及びアミノ酸リンカーBの組み合わせが、アミノ酸リンカーA(-Pro-Val-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Arg)である、請求項8記載のタンパク

【請求項10】
 
細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞の活動電位の測定方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)が蛍光タンパクのN末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする方法。

【請求項11】
 
細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞内カルシウムイオンのイメージング方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)が蛍光タンパクのN末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする方法。

【請求項12】
 
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されている、カルシウム指示遺伝子であり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、カルシウム指示遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む、請求項10記載の細胞活動電位の測定方法又は請求項11記載の細胞内カルシウムイオンのイメージング方法。

【請求項13】
 
細胞の活動電位の測定及び/又は細胞内カルシウムイオンのイメージングのためのカルシウム指示試薬であって、
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、カルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているDNA又は該DNAを含むベクターを含む、試薬であり、
ckkap配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列である、試薬。

【請求項14】
 
前記細胞が神経細胞である、請求項13記載の試薬。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2016527634thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Elucidation of the Principles of Formation and Function of the Brain Neural Network and Creation of Control Technologies AREA
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