非酵素的核酸鎖結合方法
| 国内特許コード | P170014267 |
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| 整理番号 | (K041P06) |
| 掲載日 | 2017年6月23日 |
| 出願番号 | 特願2016-544965 |
| 登録番号 | 特許第6703948号 |
| 出願日 | 平成27年8月26日(2015.8.26) |
| 登録日 | 令和2年5月13日(2020.5.13) |
| 国際出願番号 | JP2015004294 |
| 国際公開番号 | WO2016031247 |
| 国際出願日 | 平成27年8月26日(2015.8.26) |
| 国際公開日 | 平成28年3月3日(2016.3.3) |
| 優先権データ |
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| 発明者 |
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| 出願人 |
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| 発明の名称 | 非酵素的核酸鎖結合方法 |
| 発明の概要 | 核酸鎖と核酸鎖とを、天然型の構造あるいはこれに類似の構造によって結合するための技術として、核酸鎖と核酸鎖とを酵素反応に依らずに結合させる方法であって、ホスホロチオエート基を有する核酸鎖を、求電子剤の存在下で、水酸基又はアミノ基を有する核酸鎖と反応させる手順を含む、非酵素的核酸鎖結合方法を提供する。 |
| 従来技術、競合技術の概要 |
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ:ＲＮＡｉ）は、標的とする遺伝子の発現を特異的に抑制するための手法として、分子生物学、薬学及び医学等の分野で重要となっている。ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と称される、２０～２３ヌクレオチドの短い２本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することによって誘導できる。しかし、ｓｉＲＮＡは、小分子であるものの細胞膜透過性が十分でなく、また血清中での安定性も不十分であるために、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉの誘導効率には改善の余地があった。また、ｓｉＲＮＡは、Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒなどのパターン認識受容体を介して自然免疫を活性化してしまうという問題がある。 本発明者らは、特許文献１において、ｓｉＲＮＡなどの機能性核酸分子を細胞に取り込み容易な形態にして細胞内に導入し、細胞内で機能性分子を構築する方法を開示している（非特許文献１も参照）。この方法は、１または２本の核酸鎖からなる機能性核酸分子の構築法であって、以下の工程１）および２）を含んでいる。 上記の方法は、機能性核酸分子を構成する核酸鎖の少なくとも一部を複数の断片として細胞に導入し、細胞内で機能性核酸分子を構築させるものである（以下「細胞内ビルトアップ法」とも称する）。この方法では、一方の断片の「対応する末端」に求電子基を、他方の断片の「対応する末端」に求核基を結合させ、これらの化学反応により断片同士を結合させている。具体的には、求電子基としてヨードアセチル基、ブロモアセチル基又はヨード基を、求核基としてホスホロチオエート基を用い、これらの化学反応によって２つの断片のリボースを連結させている。 |
| 産業上の利用分野 |
本発明は、酵素反応に依らず化学反応によって核酸鎖と核酸鎖とを結合する方法、これを応用した核酸鎖の塩基配列の決定方法及び機能性核酸分子の細胞内導入方法に関する。より詳しくは、核酸鎖間の結合を、天然型構造又はこれに類似の構造で形成可能な非酵素的核酸鎖結合方法等に関する。 |
| 特許請求の範囲 |
【請求項1】 核酸鎖と核酸鎖とを酵素反応に依らずに結合させる方法であって、 ホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖を、ハロゲンを離脱基とする求電子剤の存在下で、水酸基又はアミノ基を有する第二の核酸鎖と反応させる手順を含み、ここで、 前記ホスホロチオエート基が核酸鎖の３'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が核酸鎖の５'末端に存在し、前記ホスホロチオエート基が核酸鎖の５'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が核酸鎖の３'末端に存在し、 前記求電子剤は、 前記脱離基を脱離させて、当該脱離基が結合していた部位において第一の核酸鎖のホスホロチオエート基の硫黄原子に結合し、さらに、 前記第二の核酸鎖の水酸基の酸素原子又はアミノ基の窒素原子と求核置換し、第一の核酸鎖のホスホロチオエート基から硫黄原子を、第二の核酸鎖の水酸基又はアミノ基から水素原子を抜き取って脱離し、これによって、 第一の核酸鎖のリン酸基のリン原子と、第二の核酸鎖の酸素原子又は窒素原子を、硫黄原子を含まない構造によって結合するものである、 非酵素的核酸鎖結合方法。 【請求項2】 前記求電子剤が下記式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で示される化合物である、請求項１記載の非酵素的核酸鎖結合方法。 【化１】 （省略） （式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立してＮＯ2基、ＯＣＯＣＨ3基、ＣＮ基、ＣＦ3基、ＣＯ2Ｈ基、ＣＯ2ＣＨ3基又はＮＨ2基を示し、 Ｌは、Ｆ及びＣｌから選択される脱離基を示し、 Ｒ4は、ＮＨ2、ＮＨＰｈ、ＮＨＰｈ－ＯＣＨ3を示す。） 【請求項3】 前記求電子剤が、１－フルオロ－２，４－ジニトロベンゼン又はトリニトロクロロベンゼンである、請求項２記載の非酵素的核酸鎖結合方法。 【請求項4】 核酸鎖の塩基配列の決定方法であって、 前記核酸鎖に相補的な塩基配列を有し、５'末端又は３'末端にホスホロチオエート基を有する相補鎖を、ハロゲンを離脱基とする求電子剤の存在下で、３'位又は５'位に水酸基又はアミノ基を有し、塩基に応じて異なる標識がされたヌクレオシドの混合物と反応させる手順、ここで、 前記ホスホロチオエート基が相補鎖の３'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基がヌクレオチシドの５'位に存在し、前記ホスホロチオエート基が相補鎖の５'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基がヌクレオシドの３'位に存在し、 前記求電子剤は、 前記脱離基を脱離させて、当該脱離基が結合していた部位において前記相補鎖のホスホロチオエート基の硫黄原子に結合し、さらに、 前記ヌクレオシドの水酸基の酸素原子又はアミノ基の窒素原子と求核置換し、前記相補鎖のホスホロチオエート基から硫黄原子を、前記ヌクレオシドの水酸基又はアミノ基から水素原子を抜き取って脱離し、これによって、 前記相補鎖のリン酸基のリン原子と、前記ヌクレオシドの酸素原子又は窒素原子を、硫黄原子を含まない構造によって結合するものである、と、 前記相補鎖に結合したヌクレオシドの標識からの信号を検出する手順と、 前記信号に基づいて、塩基核酸鎖の塩基配列を決定する手順と、を含む方法。 【請求項5】 前記ヌクレオチドは、５'位又は３'位のホスホロチオエート基と、該ホスホロチオエート基にジスルフィド結合を介して結合した標識物質とを有し、該標識物質からの信号を検出した後、前記ジスルフィド結合を還元して前記標識物質を前記相補鎖から遊離させる手順を含む、請求項４記載の方法。 【請求項6】 機能性核酸分子を細胞内に導入する方法であって、 前記機能性核酸分子を構成し得る、ホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖と、前記機能性核酸分子を構成し得る、水酸基又はアミノ基を有する第二の核酸鎖と、 ハロゲンを離脱基とする求電子剤と、 を細胞内に導入する導入手順を含み、ここで、 前記ホスホロチオエート基が第一の核酸鎖の３'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が第二の核酸鎖の５'末端に存在し、前記ホスホロチオエート基が第一の核酸鎖の５'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が第二の核酸鎖の３'末端に存在し、 前記求電子剤は、 前記脱離基を脱離させて、当該脱離基が結合していた部位において第一の核酸鎖のホスホロチオエート基の硫黄原子に結合し、さらに、 前記第二の核酸鎖の水酸基の酸素原子又はアミノ基の窒素原子と求核置換し、第一の核酸鎖のホスホロチオエート基から硫黄原子を、第二の核酸鎖の水酸基又はアミノ基から水素原子を抜き取って脱離し、これによって、 第一の核酸鎖のリン酸基のリン原子と、第二の核酸鎖の酸素原子又は窒素原子を、硫黄原子を含まない構造によって結合するものである、 方法。 【請求項7】 前記ホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖を、前記求電子剤の作用により、前記水酸基又はアミノ基を有する第二の核酸鎖と結合させて、前記機能性核酸分子を細胞内で生成させる組立手順を含む、請求項６記載の方法。 【請求項8】 機能性核酸分子を細胞内に導入する方法であって、 前記機能性核酸分子を構成し得る、ホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖と、ハロゲンを離脱基とする求電子剤と反応させて、ホスホロチオエート基に求電子剤を結合させる活性化手順と、 前記機能性核酸分子を構成し得る、水酸基又はアミノ基を有する核酸鎖を有する第二の核酸鎖と、前記求電子剤が結合したホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖と、を細胞内に導入する導入手順と、を含み、ここで、 前記ホスホロチオエート基が第一の核酸鎖の３'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が第二の核酸鎖の５'末端に存在し、前記ホスホロチオエート基が第一の核酸鎖の５'末端に存在するとき、前記水酸基又はアミノ基が第二の核酸鎖の３'末端に存在し、 前記求電子剤は、 前記脱離基を脱離させて、当該脱離基が結合していた部位において第一の核酸鎖のホスホロチオエート基の硫黄原子に結合し、さらに、 前記第二の核酸鎖の水酸基の酸素原子又はアミノ基の窒素原子と求核置換し、第一の核酸鎖のホスホロチオエート基から硫黄原子を、第二の核酸鎖の水酸基又はアミノ基から水素原子を抜き取って脱離し、これによって、 第一の核酸鎖のリン酸基のリン原子と、第二の核酸鎖の酸素原子又は窒素原子を、硫黄原子を含まない構造によって結合するものである、 方法。 【請求項9】 前記求電子剤が結合したホスホロチオエート基を有する第一の核酸鎖を、該求電子剤の作用により、前記水酸基又はアミノ基を有する第二の核酸鎖と結合させて、前記機能性核酸分子を細胞内で生成させる組立手順を含む、請求項８記載の方法。 |
| 国際特許分類(IPC) |
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| Fターム |
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画像
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| 出願権利状態 | 登録 |
| 参考情報 （研究プロジェクト等） | さきがけ 脳神経回路の形成・動作と制御 領域 |
『 非酵素的核酸鎖結合方法』に関するお問合せ
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