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PHOSPHOLIPASE D, POLYNUCLEOTIDE, AND PRODUCTION METHOD OF PHOSPHOLIPASE D commons

Patent code P170014493
Posted date Aug 8, 2017
Application number P2012-234402
Publication number P2014-082991A
Patent number P6013872
Date of filing Oct 24, 2012
Date of publication of application May 12, 2014
Date of registration Sep 30, 2016
Inventor
  • (In Japanese)杉森 大助
  • (In Japanese)松本 優作
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人福島大学
Title PHOSPHOLIPASE D, POLYNUCLEOTIDE, AND PRODUCTION METHOD OF PHOSPHOLIPASE D commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a phospholipase D which can act on a cholinergic plasmalogen, and can act on a lysophosphatidylcholine to inexpensively produce a lysophosphatidic acid, and a polynucleotide, which are obtained from a microorganism easily handled, and to provide a production method of the phospholipase D.
SOLUTION: A phospholipase D which exerts an action in which a cholinergic plasmalogen and a tertiary phosphoric ester of a lysophospholipid are hydrolyzed to liberate a choline, includes either one of polypeptides described in (a) to (c): (a) a polypeptide containing an amino acid sequence consisting of a specific sequence; (b) a polypeptide containing an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, inserted, deleted and/or added in the amino acid sequence consisting of the specific sequence, and having hydrolytic activity; and (c) a polypeptide containing at least 90% of homology with the amino acid sequence consisting of the specific sequence, and having hydrolytic activity.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

リゾリン脂質は、酵素であるホスホリパーゼA1、A2、Bなどの加水分解作用によって、基質であるリン脂質から生成される化合物であり、細胞内で代謝に深く関わっていることが知られている。

特にリゾホスファチジルコリンに作用する酵素であるリゾホスホリパーゼDは、別名オートタキシン(ATX:Autotaxin)として知られ、癌細胞の運動性を促進するだけでなく、ホストの血管形成を促進することにより癌の形成に深く関与することが知られている。オートタキシンにより生成されるリゾホスファチジン酸が信号の役割をしていることも知られている。

そして、血清、血漿中のリゾホスファチジルコリンは動脈硬化と相関があり、リゾホスファチジン酸は発毛を促進する効果があることも発見されている。

動脈硬化と相関がある血清、血漿中のリゾホスファチジルコリンを定量する方法として酵素法が知られているが、微生物由来酵素が見つかっていないため、従来は酵素を高コストで製造しているものと考えられる。また、従来のリゾホスファチジン酸の製造方法も、高コストな天然物からの抽出法である。

また、アルツハイマー型認知症とコリン型プラズマローゲンの血中濃度とは相関があるので、コリン型プラズマローゲンに作用するホスホリパーゼDが発見されれば、体外診断薬酵素として利用可能であると期待されている。しかし、コリン型プラズマローゲンに作用するホスホリパーゼDはこれまで発見されていない。

特許文献1に記載の酵素は、ラット由来のものであり、大量生産が難しく、活性も極めて低い。また、選択性が低くスフィンゴミエリンにも作用するため定量性が低いと予想される。そこで、安全で安価な微生物由来の酵素で、活性及び選択性が高い酵素が開発できれば、体外診断薬用酵素への応用が期待できると考えられる。

特に微生物由来ではBacillus cereus, Clostridiumperfringens, Actinomadura sp.の酵素が知られている。前二者は病原性微生物であり、Actinomadurasp.は放線菌であるが、これらの酵素のアミノ酸配列は明らかにされていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の3位リン酸ジエステルを加水分解してコリンなどを遊離させる作用を有する新規なホスホリパーゼD、前記ホスホリパーゼDをコードするポリヌクレオチド、前記ホスホリパーゼDの製造方法、コリン型プラズマローゲンの測定方法、リゾホスファチジルコリンの測定方法、リゾホスファチジン酸の製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ホスホリパーゼDであって、前記ホスホリパーゼDは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の3位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のポリペプチドを含み、コリン型プラズマローゲンを基質とした場合に、トリトンX-100(濃度0%)の非存在下、pH5.6で65℃にて5分間の条件での加水分解活性を100%としたときに、前記条件での加水分解活性(相対活性)が、リゾホスファチジルコリン(LPC)に対して80%以下、ホスファチジルコリン(PC)に対して70%以下、コリン型リゾプラズマローゲン(LPLS-PC)に対して15%以下、スフィンゴミエリン(SM)に対して10%以下、グリセロール-3-ホスホコリン(GPC)に対して1%以下であり、トリトンX-100(濃度0.1%)の存在下、pH5.6で65℃にて5分間の条件での加水分解活性を100%としたときに、前記条件での加水分解活性が、リゾホスファチジルコリンに対して5%以下、ホスファチジルコリンに対して60%以下、コリン型リゾプラズマローゲン、スフィンゴミエリン及びグリセロール-3-ホスホコリンに対して2%以下である基質特異性を有する、ホスホリパーゼD:
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド;又は
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。

【請求項2】
 
リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、pH5.6で37℃にて5分間の条件での加水分解活性を100%としたときに、pH4.4からpH7.2の範囲内で50%以上の加水分解活性を示す、請求項1に記載のホスホリパーゼD。

【請求項3】
 
リゾホスファチジルコリンを基質とした場合に、pH5.6で65℃にて5分間の条件での加水分解活性を100%としたときに、37℃から80℃の範囲内で50%以上の加水分解活性を示す、請求項1又は2に記載のホスホリパーゼD。

【請求項4】
 
SDS-PAGEで測定した場合の分子量が50,000~60,000の範囲内である、請求項1乃至3のいずれか一項に記載のホスホリパーゼD。

【請求項5】
 
ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物に由来する、請求項1乃至4のいずれか一項に記載のホスホリパーゼD。

【請求項6】
 
請求項1乃至5のいずれか一項に記載のホスホリパーゼDをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項7】
 
以下の(a)又は(b)に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項6に記載のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド;又は
(b)配列番号1に記載の塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。

【請求項8】
 
ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する微生物に由来する、請求項6又は7に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】
 
請求項6乃至8のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する微生物からホスホリパーゼDを産生させる工程を含む、ホスホリパーゼDの製造方法。

【請求項10】
 
ホスホリパーゼDを用いた試料中のコリン型プラズマローゲンの測定方法であって、
前記ホスホリパーゼDは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の3位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のポリペプチドを含む、
コリン型プラズマローゲンの測定方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド;又は
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。

【請求項11】
 
ホスホリパーゼDを用いた試料中のリゾホスファチジルコリンの測定方法であって、
前記ホスホリパーゼDは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の3位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のポリペプチドを含む、
リゾホスファチジルコリンの測定方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド;又は
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。

【請求項12】
 
前記試料がリン脂質の混合物であり、トリトンX-100の存在下及び非存在下の両方で前記ホスホリパーゼDを用いる、
請求項10又は11に記載の測定方法。

【請求項13】
 
ホスホリパーゼDを用いてリゾホスファチジルコリンを加水分解することによってリゾホスファチジン酸を製造するリゾホスファチジン酸の製造方法であって、
前記ホスホリパーゼDは、コリン型プラズマローゲン及びリゾリン脂質の3位リン酸エステルを加水分解してコリンを遊離させる作用を有し、以下の(a)から(c)のいずれかに記載のポリペプチドを含む、
リゾホスファチジン酸の製造方法。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド;又は
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%の同一性を有し、かつ前記加水分解作用を示すポリペプチド。
IPC(International Patent Classification)
F-term
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