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(In Japanese)ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット

Patent code P170014506
File No. (AF19P016)
Posted date Aug 16, 2017
Application number P2016-549922
Patent number P6522636
Date of filing Sep 9, 2015
Date of registration May 10, 2019
International application number JP2015004577
International publication number WO2016047068
Date of international filing Sep 9, 2015
Date of international publication Mar 31, 2016
Priority data
  • P2014-192311 (Sep 22, 2014) JP
Inventor
  • (In Japanese)野地 博行
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title (In Japanese)ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキット
Abstract (In Japanese)ターゲット分子と、前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、前記複合体と、を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含むターゲット分子の検出方法を提供する。検出抗体の担体への非特異的吸着により生じるノイズを排除して、ターゲット分子からのシグナルを高感度かつ高精度に検出することが可能となる。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

種々の疾患の早期診断を目的として、生体サンプル中に低濃度に存在する疾病マーカー(バイオマーカー)を高感度に検出するためのバイオセンシング技術が求められている。例えば、体積1mm3の腫瘍に含まれる100万個の癌細胞のそれぞれからバイオマーカー100分子が5Lの血中に分泌された場合、バイオマーカーの血中濃度は30aM程度となる。このような非常に低濃度のターゲット分子を検出可能な技術が求められている。

非特許文献1には、一分子の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてタンパク質を検出する方法が記載されている。この方法では、タンパク質特異的な抗体で覆われた微細なビーズによって微量のタンパク質を捕捉し、ビーズとタンパク質との複合体を蛍光標識させる。この複合体を含むビーズを遠心力によって反応チャンバーに導入し、タンパク質を捕捉しているビーズの数を数えることによって、タンパク質を定量的に測定する。

特許文献1には、「一分子デジタル計数デバイス」として、超高密度に微小な液滴を形成可能なアレイデバイスが開示されている。ELISAを微小な体積の液滴中で行うことで、ターゲット分子からのシグナルを2値化して測定を行うことができる(デジタルELISA法)。具体的には、まず、ターゲット分子、捕捉抗体を表面修飾したビーズ、及び検出抗体を反応させ、ビーズ表面上に「捕捉抗体-ターゲット分子-検出抗体」の複合体を形成させる。ターゲット分子の濃度が低い場合、個々のビーズは、複合体を1分子のみ結合しているか、全く結合していないかのどちらかになる。次に、アレイデバイスに形成した多数の微小液滴のそれぞれにビーズを1つずつ封入する。そして、検出抗体に由来するシグナルを発する液滴の数をターゲット分子の数としてカウントする。これにより、ターゲット分子からのシグナルを0か1に2値化して、ターゲット分子の検出及び定量を高感度かつ高精度に行うことができる。

本発明に関連して、特許文献2には、酵素免疫検査法において、目的物質と反応する抗体の標識として制限酵素を用い、制限酵素の切断塩基配列を有するDNA鎖を複合体の制限酵素により切断し、該切断されたDNA鎖断片を分析して測定することにより目的物質を検出する方法が開示されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキットに関する。より詳しくは、ターゲット分子を、担体上における該ターゲット分子と抗体との抗原抗体反応に基づいて検出する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ターゲット分子と、
前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、
を反応させて、前記担体上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
前記複合体と、
を反応させて、前記蛍光物質から発せられる蛍光を検出する検出手順と、
蛍光波長の異なる二以上の蛍光の検出信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理
する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法。

【請求項2】
 
前記複合体形成手順と前記検出手順との間に、基板上に形成された液滴のそれぞれに前記担体を一つずつ封入する封入手順を含む、請求項1記載の検出方法。

【請求項3】
 
前記担体がマイクロビーズである、請求項1又は2記載の検出方法。

【請求項4】
 
前記第一の抗体と前記第二の抗体が前記ターゲット分子の異なるエピトープに結合する、請求項1~3のいずれか一項に記載の検出方法。

【請求項5】
 
デジタルELISA法である、請求項1~4のいずれか一項に記載の検出方法。

【請求項6】
 
ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された担体と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、基質切断活性を有する酵素が標識された二以上の抗体であって、前記酵素の基質特異性が互いに異なる第二の抗体と、
前記酵素の切断部位を有し、該切断部位の一端側に蛍光物質が結合され他端側に消色物質が結合された二以上の基質であって、前記蛍光物質の蛍光波長が互いに異なる基質と、
を含んでなる酵素結合免疫吸着アッセイキット。
IPC(International Patent Classification)
Drawing

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JP2016549922thum.jpg
State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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