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HETEROLOGOUS END-LINKED DEFECTIVE CELL AND USE THEREOF meetings

Patent code P170014722
File No. (16-1)
Posted date Dec 14, 2017
Application number P2017-091736
Publication number P2017-201978A
Date of filing May 2, 2017
Date of publication of application Nov 16, 2017
Priority data
  • P2016-094404 (May 10, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)足立 典隆
Applicant
  • (In Japanese)公立大学法人横浜市立大学
Title HETEROLOGOUS END-LINKED DEFECTIVE CELL AND USE THEREOF meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide useful means for screening a specific inhibitor of polymerase θ and for improving gene targeting efficiency in a cell of an animal, such as a human.
SOLUTION: According to the present invention, there is provided useful means based on the finding that, as a result of intensive research, a gene mismatch can be achieved with extremely high efficiency in a mammalian cell, such as a human cell, by deleting the polymerase θ gene in addition to deficiency of nonhomologous end linkage (NHEJ). Furthermore, a polymerase θ inhibitor can be screened by utilizing its features of which: a decrease in random insertion frequency due to knockdown of polymerase θ can be easily observed in an NHEJ-inhibited animal cell; and sensitivity to a DNA double strand break induction treatment increases by combining the animal cell lacking NHEJ with polymerase θ deficiency.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ポリメラーゼθ(POLθ、POLQとも呼ばれる)は、細胞に存在するDNAポリメラーゼのうちのひとつであり、損傷乗り越えDNA合成活性を持つ。乳がん(特にトリプルネガティブ乳がん)、非小細胞肺がん、胃がん、大腸がん、口腔扁平上皮がん、卵巣がん等の多くのがんでポリメラーゼθの発現レベルが上昇しており、悪性度、予後と高い相関がみられることが近年報告されている(非特許文献1~5)。また、ポリメラーゼθの発現抑制はがん細胞特異的に放射線増感作用を発揮するとの報告もある(非特許文献6)。これらの知見より、ポリメラーゼθの阻害が各種のがんの治療等に有効であると期待されている。

マウスではポリメラーゼθ遺伝子のノックアウトマウスが樹立されている(特許文献1)。特許文献1には、ポリメラーゼθ遺伝子の抑制と免疫疾患との関係が開示されているが、ポリメラーゼθ特異的阻害剤のスクリーニングに有用なツールは開示されていない。

一方、ベクターDNAのゲノム中へのランダムな挿入を効率的に抑制し、遺伝子ターゲティング効率を上昇させる技術として、アカパンカビ(ニューロスポラ属)等の糸状菌細胞において所定の遺伝子の機能を喪失させることにより非相同末端連結(non-homologous end joining; NHEJ)を抑制する手法が開示されている(特許文献2)。しかしながら、ヒトなどの哺乳動物細胞においては、相同組換えによらないランダム挿入の頻度が糸状菌細胞と比べてはるかに高く、またNHEJとは異なるさらなる非相同的組換え経路が存在することがわかっており、特許文献2と同様の手法を動物細胞に適用しても遺伝子ターゲティングの効率を上げることはできない。また、近年の研究から、ポリメラーゼθがNHEJとは異なる非相同的組換え経路に関わっている可能性が示唆されているが(非特許文献5)、遺伝子ターゲティングとの関連についての報告はなされていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、非相同末端連結の機能が阻害された細胞、特には、非相同末端連結及びポリメラーゼθの機能が阻害された細胞、及びポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング等における該細胞の利用に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
変異又は遺伝的改変により非相同末端連結の機能が阻害されている、動物培養細胞。

【請求項2】
 
DNAリガーゼIV、Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Artemis、XLF、XRCC4、PAXX、DNAポリメラーゼλ、DNAポリメラーゼμ、53BP1、PNKP、PALF、TDP1、TDP2、Aprataxin、及びWRNから選択される非相同末端連結関連遺伝子の機能が阻害されている、請求項1記載の動物培養細胞。

【請求項3】
 
前記非相同末端連結関連遺伝子の全てのアレルが破壊されたゲノムを有する、請求項2記載の動物培養細胞。

【請求項4】
 
哺乳動物培養細胞である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の動物培養細胞。

【請求項5】
 
ヒト培養細胞である、請求項4記載の動物培養細胞。

【請求項6】
 
変異又は遺伝的改変によりポリメラーゼθの機能がさらに阻害されている、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の動物培養細胞。

【請求項7】
 
ポリメラーゼθ遺伝子の少なくとも一部のアレルが破壊されたゲノムを有する、請求項6記載の動物培養細胞。

【請求項8】
 
相同組換え実験用、ゲノム改変実験用、又は遺伝子ターゲティング実験用の細胞である、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の動物培養細胞。

【請求項9】
 
化合物の共存下及び非共存下において、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の動物培養細胞にマーカー遺伝子を含むDNA構築物を導入し、該細胞のゲノムへのDNA構築物のランダムな挿入を生じさせる工程、
マーカー遺伝子の発現を指標として、化合物共存下でのDNA構築物の挿入頻度、及び化合物非共存下でのDNA構築物の挿入頻度を調べる工程、
化合物共存下の挿入頻度が化合物非共存下の挿入頻度よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程
を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項10】
 
前記マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項9記載の方法。

【請求項11】
 
前記マーカー遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項9記載の方法。

【請求項12】
 
DNA二本鎖切断処理を施した請求項1ないし5のいずれか1項に記載の動物培養細胞を化合物の共存下及び非共存下で培養し、細胞の生存率を調べる工程、
化合物共存下の細胞生存率が化合物非共存下の細胞生存率よりも低下した化合物を、ポリメラーゼθ阻害剤候補化合物として選択する工程
を含む、ポリメラーゼθ阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項13】
 
DNA二本鎖切断誘発処理が、電離放射線照射、又はDNA二本鎖切断誘発剤による処理である、請求項12記載の方法。

【請求項14】
 
DNA二本鎖切断誘発剤が、トポイソメラーゼ2阻害剤、及び放射線類似作用物質から選択される薬剤である、請求項13記載の方法。

【請求項15】
 
DNA二本鎖切断誘発剤が、エトポシド、ブレオマイシン、及びネオカルチノスタチンから選択される薬剤である、請求項14記載の方法。

【請求項16】
 
前記動物培養細胞は、ポリメラーゼθ遺伝子の一部のアレルが破壊されたゲノムを有する、請求項9ないし15のいずれか1項に記載の方法。

【請求項17】
 
非相同末端連結の機能及びポリメラーゼθの機能が阻害された条件下において、ターゲティングベクターを動物培養細胞に導入し、該細胞内で相同組換えを生じさせることを含む、ゲノムが改変された動物培養細胞の製造方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2017091736thum.jpg
State of application right Published
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