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METHOD FOR MEASURING QUANTITY OF ANGIOTENSIN PEPTIDE IN SAMPLE AND KIT FOR DETERMINING QUANTITY OF ANGIOTENSIN PEPTIDE meetings

Patent code P180014785
File No. S2017-0798-N0
Posted date Jan 23, 2018
Application number P2017-128700
Publication number P2019-012015A
Date of filing Jun 30, 2017
Date of publication of application Jan 24, 2019
Inventor
  • (In Japanese)齋藤 亮彦
  • (In Japanese)吉田 豊
  • (In Japanese)後藤 佐和子
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人新潟大学
Title METHOD FOR MEASURING QUANTITY OF ANGIOTENSIN PEPTIDE IN SAMPLE AND KIT FOR DETERMINING QUANTITY OF ANGIOTENSIN PEPTIDE meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for measuring the quantity of angiotensin peptide in a sample, the method allowing for accurate determination of quantity of the angiotensin peptide and a kit for determining quantity of angiotensin peptide.
SOLUTION: The method for measuring the quantity of an angiotensin peptide in a sample comprises: a step 1 of mixing isotope-labeled angiotensin peptide with a sample then purifying the endogenous angiotensin peptide and isotope-labeled angiotensin peptide from the sample; step 2 of detecting and determining the quantity of the purified endogenous angiotensin peptide and the isotope-labeled angiotensin peptide using mass spectrometry. In this case, the limit of determination of quantity of angiotensin peptides is 0.1 fmol/μL or less. The kit for determining the quantity of angiotensin peptides comprises an isotope-labeled angiotensin peptide and a denaturing agent.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

レニンアンジオテンシン系(renin-angiotensin system;RAS)は生体の血圧調節で重要な役割を担い、中でも、アンジオテンシンペプチドはこの系の中心的役割を果たしているホルモンである。アンジオテンシンペプチドは、肝臓で主に産生されるアンジオテンシノーゲン(Angiotensinogen;AGT)から、レニン(Renin)、アンジオテンシン変換酵素(Angiotensin-converting enzyme;ACE)等の酵素によって生成される。心臓、腎臓等の臓器の局所及び組織のRASは、全身のRASとは異なる機序で制御されていることが指摘されているが、未だ不明な点が多い。特に、腎臓のRASに関しては、アンジオテンシンペプチドの産生場所及び産生機序に関していくつか仮説があり、生理的な意義に関しても議論がなされている。よって、腎臓等の臓器、及び、血液、尿等の生体試料中のアンジオテンシンペプチドを正確に定量することは、組織のRASの病態への関与の解明に役立つと期待される。

現在、アンジオテンシンペプチドは、放射免疫測定法(Radioimmunoassay;RIA)(例えば、非特許文献1参照)、酵素免疫測定法(Enzyme-Linked immunosorbent assay;ELISA)等、抗体を使用する免疫測定法で定量されていることが多い。

また、その他の定量方法としては、液体クロマトグラフィー(liquid chromatography;LC)及び質量分析法(mass spectrometry;MS)(以下、「LC/MS」と称する場合がある。)を組み合わせた測定法を用いて、腎臓、尿、血漿又は白色脂肪組織中のアンジオテンシンペプチドを定量した値が報告されている(例えば、非特許文献2参照)。

また、特許文献1には、LC/MSを用いて、血漿中のアンジオテンシンペプチドの量を測定することでレニン活性を測定する方法が開示されている。
さらに、特許文献2には、LC/MSを用いて、血漿中の、RASのアンジオテンシンペプチドの生成及び分解カスケードが平衡状態に達した際のアンジオテンシンペプチドの量を定量する方法が開示されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法であって、
前記試料に同位体標識アンジオテンシンペプチドを混合した後、前記試料から内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを精製する工程1と、
前記精製された前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを、質量分析法を用いて検出し、定量する工程2と、
を備え、
アンジオテンシンペプチドの定量限界が0.1fmol/μL以下であることを特徴とする方法。

【請求項2】
 
前記アンジオテンシンペプチドがアンジオテンシン1、2、3、4、1-7、1-9、1-12、アンジオテンシンA及びアラマンディンからなる群のうち少なくとも一つである請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
2種類以上のアンジオテンシンペプチドの量を同時に測定する請求項2に記載の方法。

【請求項4】
 
前記工程2において、三連四重極質量分析計を用いて、多重反応モニタリングを使用して検出する請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】
 
前記多重反応モニタリングで2つ以上の質量遷移を検出し、定量する請求項4に記載の方法。

【請求項6】
 
前記工程1において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを液体クロマトグラフィーにより分離精製する請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】
 
前記工程1において、前記試料から前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを固相抽出法により分離精製する請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】
 
前記工程1において、前記試料が体液であり、
前記試料に変性剤を添加し、前記試料中のタンパク質を変性させて沈殿させ、前記沈殿物のうち、前記内因性アンジオテンシンペプチド及び前記同位体標識アンジオテンシンペプチドを再可溶化させて分離精製する請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】
 
前記試料が腎臓由来の組織抽出液又は尿である請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】
 
同位体標識アンジオテンシンペプチドと、
変性剤と、
を備えることを特徴とするアンジオテンシンペプチドの定量キット。

【請求項11】
 
前記変性剤が、尿素、チオ尿素及びジチオスレイトールからなる群の少なくとも1つである請求項10に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。

【請求項12】
 
さらに固相抽出カラムを備える請求項10又は11に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。

【請求項13】
 
2種類以上の同位体標識アンジオテンシンペプチドを備える請求項10~12のいずれか一項に記載のアンジオテンシンペプチドの定量キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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