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CELL ORGANELLE-LOCALIZED FUSION PROTEIN meetings

Patent code P180014793
File No. S2016-0187-N0
Posted date Jan 24, 2018
Application number P2016-106328
Publication number P2017-209080A
Date of filing May 27, 2016
Date of publication of application Nov 30, 2017
Inventor
  • (In Japanese)守屋 央朗
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岡山大学
Title CELL ORGANELLE-LOCALIZED FUSION PROTEIN meetings
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell organelle-localized fusion protein that enables high-precision observation of a cell organelle and a cell organelle-localized protein, a nucleic acid encoding the protein, an expression vector containing the nucleic acid, and a cell into which the nucleic acid has been introduced, and to provide a method for visualizing a cell organelle with a high degree of accuracy.
SOLUTION: According to the present invention, there are provided a fusion protein comprising a localization signal peptide to a cell organelle, a fluorescent protein, and a proteasome degradation signal peptide; a nucleic acid encoding the fusion protein; an expression vector containing the nucleic acid; a cell into which the nucleic acid has been introduced; and a method for visualizing a cell organelle, the method comprising the step of expressing the fusion protein in a cell.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

蛍光タンパク質を用いた、ミトコンドリア、小胞体などの細胞小器官の観察、及び細胞内のタンパク質の局在解析は、分子生物学及び細胞生物学において広く一般的に行われている。

蛍光タンパク質を用いた解析では、できるだけ明るく、見たい部位以外のバックグラウンドが低いことが求められる。蛍光タンパク質の蛍光強度を改善したり、顕微鏡自体を改善したりすることはその解決策の1つと言える。もう一つの最も簡便な改善法は、遺伝子工学的に蛍光タンパク質の発現量を上げることである。

しかしながら、蛍光タンパク質の発現量を上げた場合には、見たい部位に蛍光タンパク質が上手く局在化しない「もれ」により、バックグラウンドの上昇が生じてしまう。すなわち、「明るさ」と「バックグラウンドの低さ」とはトレードオフの関係にある。

また、多くのタンパク質は、細胞内のどこで働いているかわかっていない。そのため、蛍光タンパク質と融合させて局在を観察する実験が頻繁に行われるが、上述の「もれ」の問題のため、正確な局在を知ることができないことが多い。

タンパク質不安定化配列(デグロン(degron))をタンパク質に付加することにより、プロテアソームによる分解が誘導され、当該タンパク質の半減期を減少させることが可能となる。このようなデグロンとしては、オルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)のC末端領域(cODC)、サイクリンのC末端領域、CLペプチド(例えば、CL1、CL2、CL6、CL9、CL10、CL11、CL12、CL15、CL216、CL17、SL17など)などが知られている。さらには、N末端が特定のアミノ酸となることにより、タンパク質が不安定化してプロテアソームにより分解されることも知られている(N-デグロン)。プロテアソームの基質のほとんどは、ポリユビキチン鎖を介して認識されるが、cODCはユビキチンとは関係がない機構によりプロテアソームにより認識される。

このようなデグロンを利用した技術が、特許文献1及び2において報告されている。

特許文献1では、レポータータンパク質と少なくとも2つの異なる異種タンパク質不安定化配列とを含有するポリペプチドについて報告されている。このように、タンパク質不安定化配列を2つ組み合わせて使用することで、タンパク質の分解速度を増大させることができることが述べられている。

また、特許文献2では、アミロイド線維を形成しうるタンパク質と、プロテアソーム分解シグナルタンパク質と、標識物質とを発現させた細胞に被験物質を接触させて標識物質のシグナルを検出することで、プロテアソームの機能阻害を抑制する物質(神経変性疾患治療用物質)をスクリーニングする方法について報告されている。具体的には、緑色蛍光タンパク質(GFP)にプロテアソーム分解シグナルタンパク質(CL1)を付加したGFP-CL1を利用したアッセイ系が記載されている。

しかしながら、特許文献1及び2のいずれにも、「明るさ」と「バックグラウンドの低さ」を両立させるために、デグロンを利用することは記載されていない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、細胞小器官局在性融合タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸が導入された細胞に関する。さらに、本発明は、細胞小器官を可視化する方法、及び細胞内におけるタンパク質の局在性を分析する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
細胞小器官への局在化シグナルペプチドと、蛍光タンパク質と、プロテアソーム分解シグナルペプチドとから構成される融合タンパク質。

【請求項2】
 
前記細胞小器官が、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム、液胞、又はリソソームである、請求項1に記載の融合タンパク質。

【請求項3】
 
前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項5】
 
請求項4に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項6】
 
請求項4に記載の核酸が導入された細胞。

【請求項7】
 
請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞小器官を可視化する方法。

【請求項8】
 
細胞内局在性が未知のタンパク質と、蛍光タンパク質と、プロテアソーム分解シグナルペプチドとから構成される融合タンパク質を細胞内で発現させる工程を含む、細胞内におけるタンパク質の局在性を分析する方法。

【請求項9】
 
前記プロテアソーム分解シグナルペプチドが、オルニチンデカルボキシラーゼのC末端領域由来のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項8に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
(In Japanese)特許内容に関しての問い合せ窓口は岡山大学連携機構知的財産部門です。
技術移転に関しては岡山TLOが窓口になります。


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