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(In Japanese)オリゴヌクレオチド誘導体及びそれを用いたオリゴヌクレオチド構築物並びにそれらの製造方法 UPDATE_EN

Patent code P180014962
File No. (S2015-0845-N0)
Posted date May 22, 2018
Application number P2017-508427
Patent number P6667179
Date of filing Mar 24, 2016
Date of registration Feb 27, 2020
International application number JP2016059398
International publication number WO2016152980
Date of international filing Mar 24, 2016
Date of international publication Sep 29, 2016
Priority data
  • P2015-060689 (Mar 24, 2015) JP
Inventor
  • (In Japanese)北出 幸夫
  • (In Japanese)柴田 綾
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人岐阜大学
Title (In Japanese)オリゴヌクレオチド誘導体及びそれを用いたオリゴヌクレオチド構築物並びにそれらの製造方法 UPDATE_EN
Abstract (In Japanese)
【課題】
 合成が容易であり、リポフェクション試薬を用いることなく細胞内に導入することができる、新たなオリゴヌクレオチド誘導体を提供する。
【解決手段】
 本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、例えば(1)で示される。この誘導体は細胞表面のリガンドにアミノ糖鎖部分が結合し、細胞内に導入されると考えられ、選択的なドラッグデリバリー機能が期待できる。
(式省略)
【選択図】
 図1
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、DNAやRNAなど各種のオリゴヌクレオチドが治療、診断等の用途に用いられるようになってきている。例えば、注目されている核酸技術として、RNA干渉(RNAi)を利用した、特定遺伝子のノックダウン法が挙げられる。RNAiとは、二本鎖RNA(dsRNA)の働きによって、それと配列の相同な遺伝子の働きが抑制される現象をいう。このRNAiを利用した核酸医薬は、次世代の治療薬として、大きな期待が寄せられている。

一方、オリゴヌクレオチドを化学修飾して、天然型には無い、新たな機能を付与する研究も行われている。本発明者らも、オリゴヌクレオチドの末端にエチニル基を導入し、さらに、このエチニル基に対し、クリック反応を利用してベンゼン環等の新たな置換基を修飾する技術を開発している(特許文献1)。また、この技術で得られた人工のオリゴヌクレオチドが、天然型オリゴヌクレオチドと比べて高いヌクレアーゼ耐性を有しており、細胞内で分解され難いという結果を得ている。

しかし核酸自体はマイナス電荷を帯びており、細胞膜を透過することができない。このため、核酸医薬においては、ヌクレオチドが細胞膜を通過できるようなdrug delivery system (DDS)が必要となる。現在、ヌクレオチドを細胞内に導入する方法として、リポソームを利用したリボフェクション法が開発されている。この方法は、負の電荷を持つDNAの周りに、正の電荷を持つ陽イオン性リポソームが結合した複合体を形成させて、エンドサイトーシス現象により細胞表面から細胞内にDNA等を取り込ませる方法である。

しかし、上記リポフェクション法に用いられるリポフェクション試薬は、肝臓や腎臓に対する毒性があり、問題となっていた。また、リポフェクション法は、単なるエンドサイトーシスを利用したDDSであり、細胞に対する選択性に欠けていた。

こうした問題を解決するため、オリゴヌクレオチドの3´末端にアシアロ糖-ペプチド鎖を導入し、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)を通して細胞内に導入するという、化学修飾オリゴヌクレオチドが開発されている(特許文献2、3)。しかし、この方法では、図4に示されているような、三本のアシアロ糖-ペプチド鎖を有する複雑な化学構造を有しており、合成するためには煩雑な操作が必要となる。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、オリゴヌクレオチド誘導体及びそれを用いたオリゴヌクレオチド構築物並びにそれらの製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
次式(1)で表されるオリゴヌクレオチド誘導体(式中、Rl及びR2は、それぞれ独立して水素又はリン酸基を表し、a、b及びCは独立して0以上の整数であって少なくとも1つが1以上であり、A及びBは独立して改変されてもよいオリゴヌクレオチドであってAとBとを合わせた鎖長が3以上のオリゴヌクレオチドを表す。ただし、A及びBにおいてオリゴヌクレオチドの3'末端と5'末端の水酸基を含まない。また、式中S1は下記(α)で示される置換基である)。
【化1】
 
(省略)

【請求項2】
 
次式(2)で表されるオリゴヌクレオチド誘導体(式中、Rl及びR2は、それぞれ独立して水素又はリン酸基を表し、a、b及びCは独立して0以上の整数であって少なくとも1つが1以上であり、A及びBは独立して改変されてもよいオリゴヌクレオチドであってAとBとを合わせた鎖長が3以上のオリゴヌクレオチドを表す。ただし、A及びBにおいてオリゴヌクレオチドの3'末端と5'末端の水酸基を含まない。また、四角で囲ったLINKERの文字はリンカーを示し、S2は該リンカーの末端に結合する下記(β),(γ),(δ),又は(ε)で示される置換基(複数個のS2が該リンカーに結合していてもよい)であり、nは0-4の自然数を示す)。
【化2】
 
(省略)

【請求項3】
 
前記独立して改変されてもよいオリゴヌクレオチドには-(CH2)n-(ただしnは1以上の自然数)という部分構造が含まれていることを特徴とする請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項4】
 
R1及びR2はHであることを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項5】
 
bは0であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項6】
 
a及びbはともに0であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項7】
 
cは1以上5以下であることを特徴とする請求項1乃至6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項8】
 
A及びBは、所定の遺伝子mRNAの部分配列又はその相補配列を有する請求項1乃至7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項9】
 
A及びBを合わせた鎖長は、10以上35以下である請求項1乃至8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項10】
 
A及びBはオリゴリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項1乃至9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。

【請求項11】
 
遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって、請求項1乃至10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。

【請求項12】
 
1本鎖及び2本鎖DNA、1本鎖及び2本鎖RNA、DNA/RNAキメラ並びにDNA/RNAハイブリッドから選択される遺伝子発現調節用オリゴヌクレオチド構築物であって請求項11に記載の構築物。

【請求項13】
 
アンチジーン、アンチセンス、アプタマー、siRNA、miRNA、shRNA及びリポザイムから選択される請求項11又は12に記載の構築物。

【請求項14】
 
ダングリングエンド部分に以下の式(4)又は(5)で表されるユニットを有する請求項11乃至13のいずれか1項記載の構築物(式中、S1は下記(α)で示される置換基である。また、四角で囲ったLINKERの文字はリンカーを示し、S2は該リンカーの末端に結合する下記(β),(γ),(δ),又は(ε)で示される置換基(複数個のS2が該リンカーに結合していてもよい)であり、nは0~4の自然数を示す)。
【化3】
 
(省略)

【請求項15】
 
siRNAであって、前記オリゴヌクレオチド誘導体において、a及びbは0であり、cは1又は2であり、3’末端ダングリングエンド部分に以下の式(4)又は(5)で表されるユニットを含む請求項14記載の構築物(式中、S1は下記(α)で示される置換基である。また、四角で囲ったLINKERの文字はリンカーを示し、S2は該リンカーの末端に結合する下記(β),(γ),(δ),又は(ε)で示される置換基(複数個のS2が該リンカーに結合していてもよい)であり、nは0~4の自然数を示す)。
【化4】
 
(省略)

【請求項16】
 
遺伝子診断用オリゴヌクレオチド構築物であって、請求項1乃至10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を有する構築物。

【請求項17】
 
プローブであることを特徴とする請求項16に記載の構築物。

【請求項18】
 
オリゴヌクレオチドに、少なくとも1個の以下の式(4)又は(5)で表されるユニットを付加、置換及び挿入のいずれか又はこれらを組み合わせて導入することを特徴とするオリゴヌクレオチドの修飾方法(式中、S1は下記(α)で示される置換基である。また、四角で囲ったLINKERの文字はリンカーを示し、S2は該リンカーの末端に結合する下記(β),(γ),(δ),又は(ε)で示される置換基(複数個のS2が該リンカーに結合していてもよい)であり、nは0~4の自然数を示す)。
【化5】
 
(省略)
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

※Click image to enlarge.

JP2017508427thum.jpg
State of application right Registered
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