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コラーゲン融合タンパク質、及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法 NEW 新技術説明会

国内特許コード P180015021
整理番号 (S2015-0733-N0)
掲載日 2018年5月24日
出願番号 特願2017-508372
出願日 平成28年3月22日(2016.3.22)
国際出願番号 JP2016059066
国際公開番号 WO2016152882
国際出願日 平成28年3月22日(2016.3.22)
国際公開日 平成28年9月29日(2016.9.29)
優先権データ
  • 特願2015-057688 (2015.3.20) JP
発明者
  • 田中 利明
  • 生駒 俊之
  • 田中 順三
出願人
  • 国立大学法人東京工業大学
発明の名称 コラーゲン融合タンパク質、及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法 NEW 新技術説明会
発明の概要 本発明の目的は、動物細胞からのプロコラーゲンの分泌を検出できるシステムの構築である。
前記課題は、Gly-Xaa-Yaa(式中、Glyはグリシンであり、そしてXaa及びYaaは任意のアミノ酸である)の繰り返しアミノ酸配列を有するプレプロコラーゲンタンパク質、プロコラーゲンタンパク質、コラーゲンタンパク質、若しくはそれらの変異体、又はそれらの断片である、コラーゲン関連タンパク質及び蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質によって解決することができる。
従来技術、競合技術の概要


コラーゲンは、生体内のタンパク質の30%を占め、骨格支持及び細胞接着などの機能を有する重要なタンパク質であり、例えば、ヒトの身体の骨・軟骨、靭帯・腱、角膜実質、皮膚、肝臓、筋肉などの組織の主要構成成分である。コラーゲンには、コラーゲン線維を形成する線維性コラーゲンと、線維を形成しない非線維性コラーゲンが存在する。線維性コラーゲンは、コラーゲンのポリペプチド鎖が3本集まって3重らせん構造(トロポコラーゲン)を形成している。この3重らせん構造のトポコラーゲンは、自己組織化することによって、分子長の1/4ずつずれて整列し、コラーゲン原線維(コラーゲン細線維)を形成する。更に、このコラーゲン原線維が、多数集合して、コラーゲン線維(コラーゲン線維束)を形成している。更に、角膜実質や皮質骨においては、コラーゲン線維は同一方向に整列した二次元の層を形成し、更にこの層が1層ごとに直行して積層したベニヤ板様三次元層板構造を取っている。このベニヤ板様三次元層板構造を有するコラーゲンは、透明で且つ高い強度を有している。



このようなコラーゲンの分子異常を起因とする疾患として膠原病(例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎)又は角膜の白濁などが挙げられるが、治療法が確立されていないものが多い。これは、コラーゲンの分泌過程および高次構造の形成過程が未解明であることも、1つの原因である。コラーゲンの分泌過程および高次構造の形成過程の解析を行うことが可能であれば、コラーゲンの分子異常を起因とする疾患の原因の解明、及びそれらの治療法の開発にも有効な手段として用いることができる。

産業上の利用分野


本発明は、コラーゲン融合タンパク質及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法、並びにコラーゲン融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、ベクターを含む大腸菌、及びそれらの製造方法に関する。本発明によれば、コラーゲン関連疾患の治療用又は予防用薬剤の候補物質をスクリーニングすることができる。また、本発明によれば、コラーゲン融合タンパク質、及びそれをコードする正常な核酸を有するベクターを得ることができる。

特許請求の範囲 【請求項1】
Gly-Xaa-Yaa(式中、Glyはグリシンであり、そしてXaa及びYaaは任意のアミノ酸である)の繰り返しアミノ酸配列を有するプレプロコラーゲンタンパク質、プロコラーゲンタンパク質、コラーゲンタンパク質、若しくはそれらの変異体、又はそれらの断片である、コラーゲン関連タンパク質と、蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質。

【請求項2】
前記蛍光タンパク質又は発光タンパク質が、プロコラーゲンタンパク質のN末端のN-プロプロテイン、コラーゲンタンパク質、又はC末端のC-プロプロテインに結合又は挿入されている、請求項1に記載の融合タンパク質。

【請求項3】
前記蛍光タンパク質又は発光タンパク質がコラーゲンタンパク質のC末端から30アミノ酸よりN末端側に挿入されており、及び/又は蛍光タンパク質又は発光タンパク質がC-プロプロテインのN末端から30アミノ酸よりC末側に挿入されている、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。

【請求項4】
請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現したコラーゲン関連疾患細胞と、試験物質とを接触させる工程、及び
融合タンパク質の動態を解析する工程、
を含むコラーゲン関連疾患の治療又は予防物質のスクリーニング方法。

【請求項5】
Gly-Xaa-Yaa(式中、Glyはグリシンであり、そしてXaa及びYaaは任意のアミノ酸である)の繰り返しアミノ酸配列を有するプレプロコラーゲンタンパク質、プロコラーゲンタンパク質、コラーゲンタンパク質、若しくはそれらの変異体、又はそれらの断片である、コラーゲン関連タンパク質、又は前記コラーゲン関連タンパク質と蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項6】
請求項5に記載の核酸を含むベクター。

【請求項7】
請求項6に記載のベクターを含む、ベクター含有宿主細胞。

【請求項8】
前記宿主細胞が、mcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(strr)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌である、請求項7に記載のベクター含有宿主細胞。

【請求項9】
前記大腸菌が、DH10B、TOP10F’、MC1061、XL1-Blue MRF’、AG1、BL21(DE3)、DB3.1、DH1、DH5α、DH5α Turbo、DH12S、DM1、E.Cloni(r)5alpha、E.Cloni(r)10G、E.Cloni(r)10GF’、ER2267、HB101、HMS174(DE3)、High-Control(tm) BL21(DE3)、High-Control(tm)10G、IJ1126、JM108、JM109、Mach1、MC1061、MFDpir、OmniMAX2、OverExpress(tm)C41(DE3)、OverExpress(tm)C43(DE3)、Rosetta(DE3)、SOLR、SS320、STBL2、STBL3、STBL4、SURE、SURE2、TG1、TOP10、XL2-Blue、XL2-BlueMRF’、及びXL10-Goldからなる群から選択される、請求項8に記載のベクター含有宿主細胞。

【請求項10】
請求項8又は9に記載のベクター含有宿主細胞から得られるベクター。

【請求項11】
請求項6に記載のベクターをmcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(strr)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌に導入することを特徴とする、ベクター含有大腸菌の製造方法。

【請求項12】
請求項6に記載のベクターをmcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(strr)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌に導入する工程、及び前記ベクターを回収する工程を含むことを特徴とする、ベクターの製造方法。

【請求項13】
(1)請求項6に記載のベクターを、動物細胞に導入する工程、及び
(2)前記ベクターが導入された動物細胞からコラーゲンを分泌させる工程、
を含む、コラーゲンの製造方法。

【請求項14】
(1)請求項6に記載のベクターを、動物細胞に導入する工程、及び
(2)前記ベクターが導入された動物細胞において蛍光又は発光を検出する工程、
を含む、コラーゲンの蛍光又は発光検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
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出願権利状態 公開
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