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METHOD FOR PRODUCING TRANSGENIC CELL AND POLYETHYLENEIMINE SUBSTITUTION POLYMER

Patent code P180015109
File No. S2017-0104-N0
Posted date Jun 20, 2018
Application number P2016-221047
Publication number P2018-074984A
Date of filing Nov 11, 2016
Date of publication of application May 17, 2018
Inventor
  • (In Japanese)松村 和明
  • (In Japanese)サナ アハマッド
  • (In Japanese)中 俊明
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
  • (In Japanese)澁谷工業株式会社
Title METHOD FOR PRODUCING TRANSGENIC CELL AND POLYETHYLENEIMINE SUBSTITUTION POLYMER
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide means for gene introduction into a cell, with excellent efficiency of gene introduction and expression.
SOLUTION: A method for producing a transgenic cell includes the steps of adding a complex of a nucleic acid and a cationic polymer or a cationic lipid, into a culture medium, to allow it to contact a cell in the culture medium; freezing the complex and the cell in the culture medium; and thawing the frozen cell.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

細胞への遺伝子導入技術として、ポリエチレンイミンなどのポリマーをナノキャリアとして使用した技術が知られている。このようなナノキャリアとDNAとの複合体を形成させた後に、細胞へ投与することによって、DNA単独で細胞へ投与した場合と比較して、高い効率で遺伝子が導入され発現する。このようなナノキャリアにおいて、遺伝子の導入と発現の効率を上昇させるために、新しいナノキャリアとなる化合物が探索されてきた(特許文献1、特許文献2)。また新しいナノキャリアとなる化合物は、細胞毒性の点においても良好であることが求められている。

細胞の凍結保存技術として、凍結保存剤を添加した凍結保存技術が知られている(特許文献3)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、遺伝子導入された細胞の製造方法、及び遺伝子導入に好適なポリエチレンイミンの置換体ポリマーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、
培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、
凍結した細胞を、解凍する工程、
を含む、遺伝子導入された細胞を製造する方法。

【請求項2】
 
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体が、
核酸と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質とを、溶液中で混合することによって複合体を形成する工程、によって形成された複合体である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、請求項1~2のいずれかに記載の方法。

【請求項4】
 
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程が、
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、細胞が分散した培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程である、請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
カチオン性ポリマーが、
ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミン、及びこれらの修飾ポリマーからなる群から選択された1種以上のカチオン性ポリマーである、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
 
ポリエチレンイミンが、直鎖型ポリエチレンイミンまたは分岐型ポリエチレンイミンである、請求項5に記載の方法。

【請求項7】
 
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、及びアミノ基が置換されてなる次のR1基:
R1基: -NH-CO-CH(CH2-COOH)R11
(ただし、R11基は、水素、又はC1~C6のアルキル基である)
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、請求項5~6のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
 
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のR1基、及びアミノ基が置換されてなる次のR2基:
R1基: -NH-CO-CH(CH2-COOH)R11
(ただし、R11基は、水素、又はC1~C6のアルキル基である)
R2基: -NH-CO-CH(CH2-COOH)R21
(ただし、R21基は、水素、又はC1~C6のアルキル基であり、R11基とは異なる基である)
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、請求項5~6のいずれかに記載の方法。

【請求項9】
 
培地が、凍結保護剤を含む培地である、請求項1~8のいずれかに記載の方法。

【請求項10】
 
凍結保護剤が、
DMSO、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、及び糖類からなる群から選択された凍結保護剤である、請求項9に記載の方法。

【請求項11】
 
請求項1~10のいずれかに記載の方法によって製造された遺伝子導入細胞の遺伝子を発現させて、遺伝子産物を製造する方法。

【請求項12】
 
アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のR1基、及びアミノ基が置換されてなる次のR2基:
R1基: -NH-CO-CH(CH2-COOH)R11
(ただし、R11基は、水素、又はC1~C6のアルキル基である)
R2基: -NH-CO-CH(CH2-COOH)R21
(ただし、R21基は、水素、又はC1~C6のアルキル基であり、R11基とは異なる基である)
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項13】
 
R11基が、水素、又はC1~C2のアルキル基であり、R21基が、C3~C5のアルキル基である、請求項12に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項14】
 
R11基が、水素であり、R21基が、ブチル基である、請求項12に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項15】
 
ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、
置換前のアミノ基のモル数を100とした場合のR1基のモル数の比率が、5~25の範囲にあり、
置換前のアミノ基のモル数を100とした場合のR2基のモル数の比率が、10~30の範囲にある、請求項12~14のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項16】
 
請求項12~15のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーからなる、遺伝子導入剤。

【請求項17】
 
請求項12~15のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーと、核酸を含む、核酸複合体組成物。

【請求項18】
 
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、請求項17に記載の核酸複合体組成物。

【請求項19】
 
請求項17~18のいずれかに記載の核酸複合体組成物によって遺伝子導入されてなる、遺伝子導入細胞。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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