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動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞

国内特許コード P180015117
整理番号 (S2015-1830-N0)
掲載日 2018年6月20日
出願番号 特願2017-535254
登録番号 特許第6713691号
出願日 平成28年3月23日(2016.3.23)
登録日 令和2年6月8日(2020.6.8)
国際出願番号 JP2016059174
国際公開番号 WO2017029833
国際出願日 平成28年3月23日(2016.3.23)
国際公開日 平成29年2月23日(2017.2.23)
優先権データ
  • 62/265425 (2015.12.10) US
  • 特願2015-162612 (2015.8.20) JP
発明者
  • 鐘巻 将人
  • 夏目 豊彰
出願人
  • 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
発明の名称 動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞
発明の概要 本発明は、次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法である。(1)0.1kbp~10kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100bp~300bpのDNAを結合したドナープラスミドを作成する工程。(2)得られたドナープラスミドを用いた相同組換え修復によるゲノム編集法により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp~10kbpの外来DNAを挿入する工程。
従来技術、競合技術の概要

近年の動物細胞のゲノム中に部位特異的改変を導入する技術、いわゆるゲノム編集技術は飛躍的に進歩した。すなわち、近年、Znフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、CRISPR-Cas9等のゲノム編集技術が利用可能になったことにより、DNA切断後の相同組換え修復(homology direct repair:HDR)を利用して、培養細胞のゲノム特定部位に外来DNAを挿入することが可能になった。この技術を利用することで、内在性遺伝子にGFP等のタグを付加できるようになった(非特許文献1~7)。一方、単鎖オリゴDNAに50~80bの相同性領域を持たせることで、部位特異的配列を改変する方法も開発された(非特許文献7、8)。ハエS2細胞において、相同性を付加したプライマーを利用したPCRで増幅したDNA断片を、そのまま利用した外来DNA挿入法が開発された(非特許文献9)。一方、ゲノム編集によるゲノム切断後にHDR経路を利用せずに、別の修復経路であるmicro-homology end-joining (MMEJ)経路を利用してタグ付加を行う技術も開発された(非特許文献10)。

産業上の利用分野

本発明は、動物細胞のゲノム中に部位特異的に外来DNAを挿入する方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法であって、前記動物細胞が、ヒトHCT116細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞及びマウスiPS細胞から選ばれる細胞である、ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法
(1)0.1kbp~kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する125bp~200bpのDNAを結合したドナープラスミドを作製する工程。
(2)得られたドナープラスミドを用いたCRISPR-Cas9システムにより誘発される相同組換えによるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp~5kbpの外来DNAを挿入する工程。

【請求項2】
前記動物細胞が、ヒトHCT116細胞、及びマウスES細胞から選ばれる細胞である、請求項1に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項3】
前記外来DNAは、Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み、
前記工程(2)において、目的タンパク質をコードする遺伝子の上流又は下流に、Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質をコードする遺伝子を挿入する、請求項1又は2に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項4】
前記Aux/IAAファミリータンパク質の少なくとも部分配列からなり、目的タンパク質の分解誘導能を有するタンパク質は、mAIDである、請求項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項5】
前記工程(1)において、前記外来DNAを、前記相同配列DNAを含むプライマーで増幅した後、Topoクローニングによって、前記ドナープラスミドを作製する、請求項1~のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項6】
前記動物細胞は、セーフハーバー座位にtransport inhibitor response 1(TIR1)をコードする遺伝子を含む染色体を有する請求項1~のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項7】
前記セーフハーバー座位がAAVS1(the AAV integration site 1)遺伝子座である請求項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項8】
前記外来DNAが、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる少なくとも一つを含む請求項1~7のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項9】
さらに、前記動物細胞の前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、請求項~8のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項10】
前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項9に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項11】
前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項10に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。

【請求項12】
前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項11に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2017535254thum.jpg
出願権利状態 登録


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