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LACTIC ACID BACTERIA WITH ENHANCED FUNCTION, METHODS FOR PRODUCING THE SAME, AND METHODS FOR ENHANCING FUNCTION OF LACTIC ACID BACTERIA

Patent code P180015169
File No. L17027,S2018-0469-N0
Posted date Jul 13, 2018
Application number P2018-050476
Publication number P2019-162039A
Date of filing Mar 19, 2018
Date of publication of application Sep 26, 2019
Inventor
  • (In Japanese)下里 剛士
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人信州大学
Title LACTIC ACID BACTERIA WITH ENHANCED FUNCTION, METHODS FOR PRODUCING THE SAME, AND METHODS FOR ENHANCING FUNCTION OF LACTIC ACID BACTERIA
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide lactic acid bacteria with enhanced function which drastically inhibits IL-4 generation.
SOLUTION: Disclosed herein is a lactic acid bacteria with enhanced function derived from a wild strain which is modified to have mutation to a gene encoding S12 ribosome protein which comprises a first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (TPKKPNSALRK) and a second amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 (RGGRVKDLPGVRY) positioned downstream the C terminus of the first amino acid sequence, where the modified strain is mutated to replace the amino acid at position 3 from the N terminus of the first amino acid sequence with a different amino acids or to replace the amino acid residue at position 6 from the N terminus of the second amino acid sequence with a different amino acid.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年プロバイオティクス乳酸菌が注目されている。プロバイオティクスとは、現在は、国連食糧農業機関と世界保健機関により、「適正量を摂取した際に宿主に有用な作用を示す生菌体」と定義されている。様々なプロバイオティクスの中でも、特に乳酸菌やビフィズス菌に関する研究結果が数多く報告されている。特に腸内環境改善作用は乳酸菌やビフィズス菌がヒトの健康に有用であると考えられ、免疫調節作用は近年アレルギーや癌予防の分野で注目を集めている。

一方、アレルギー疾患やアトピー性体質の患者数は年々増加しており、特に先進国において深刻な問題となっている。このアレルギー疾患増加の原因の1つとして「Hygiene hypothesis(衛生仮説)」が知られている。環境が衛生的になり、幼少期に細菌等にさらされる機会が減少したため、免疫応答が生来の2型ヘルパーT(Th2)細胞優位から1型ヘルパーT(Th1)細胞優位に変化せず、Th2優位の免疫応答が持続していることや、制御性T細胞が十分に誘導されていないのがその原因と考えられている。一旦アレルギー反応が生じると、体内で、このTh2はサイトカインであるIL-4を産生し、このIL-4はB細胞を刺激して、免疫グロブリンE(IgE)という抗体の産出を促す。さらにIL-4はT細胞も増加させ、その結果IgEがさらに増加し、アレルギーが加速的に悪化する。

そこで、プロバイオティック乳酸菌がTh1/Th2バランスを調節する作用を有することが注目されている。プロバイオティック乳酸菌の免疫調節作用は、動物モデルにおけるサイトカイン産生調節や免疫グロブリンE(IgE)産生抑制効果として知られている。この免疫調節作用のメカニズムの解明はまだ十分ではないが、菌体刺激によりマクロファージなどがインターロイキン(IL)-12を産生し、これによりTh1/Th2バランスがTh1寄りに傾き、IFN-γが産生されるからと考えられている(非特許文献1)。

特に、以前よりプロバイオティック乳酸菌として知られているラクトバチラス・ラムノサスGG(Lactobacillus rhamnosus GG、以降LGG)の野生株によるアトピー性皮膚炎発症予防作用が注目されている。一例として、LGGを妊婦に対して投与すると、乳児のアトピー性皮膚炎の発症率が低下することが報告されている(非特許文献2)。具体的には、妊婦をLGG投与群とプラセボ投与群に分け、生後その子どものアトピー性皮膚炎の有症率、皮疹スコア、血清総IgE、アレルゲン皮膚テストの陽性率を解析し、経時的に調査した。その結果、血清総IgE値および皮膚テストの陽性率では2群間で差異が認められなかったにもかかわらず、2歳時の有病率については、プラセボ投与群におけるが46%であったのに対し、LGG投与群では23%と半減しており、4歳時および7歳時においてもその有病率に有意な差が生じることが確認された。

乳酸菌以外では、所望の特性を有する変異株を取得する方法として、抗生物質の存在下で生育可能な変異株をスクリーニングすることにより、S12リボソームタンパク質をコードするrpsL遺伝子に突然変異を生じさせる方法が提案されている(特許文献1)。例えば、抗生物質非生産性の放線菌に抗生物質の一種であるリファンピシン耐性を付与することで、検出可能レベルの抗生物質生産能を引き出し、有用代謝産物として未知の抗生物質が産出されたことが報告されている(非特許文献3)。

また、遺伝子組換えの分野では、ウシβラクトグロブリンという乳清に含まれるタンパク質を分泌する乳酸菌の組換体を構築したことが報告されている(非特許文献4)。

Field of industrial application (In Japanese)

本開示は、乳酸菌の有する生体調節機能およびタンパク質生産能を強化した乳酸菌およびその製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列番号1(Thr-Pro-Lys-Lys-Pro-Asn-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys)の第1のアミノ酸配列と第1のアミノ酸配列よりC末端側に配列番号2(Arg-Gly-Gly-Arg-Val-Lys-Asp-Leu-Pro-Gly-Val-Arg-Tyr)の第2のアミノ酸配列とを含むS12リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された野生株由来の機能強化乳酸菌であって、
前記変異が第1のアミノ酸配列のN末端側から3位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する、または第2のアミノ酸配列のN末端側から6位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする機能強化乳酸菌。

【請求項2】
 
配列番号3(Thr-Pro-Lys-Lys-Pro-Asn-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys-Xa1-Ala-Arg-Val-Arg-Leu-Ser-Asn-Leu-Xa2-Glu-Val-Thr-Ala-Tyr-Ile-Pro-Gly-Ile-Gly-His-Asn-Leu-Gln-Glu-His-Ser-Val-Val-Leu-Xa3-Arg-Gly-Gly-Arg-Val-Lys-Asp-Leu-Pro-Gly-Val-Arg-Tyr)(Xa1はTyrまたはPhe、Xa2はIleまたはMet、Xa3はIleまたはLeu)のアミノ酸配列を含むS12リボソームタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するように改変された機能強化乳酸菌であって、
前記変異が配列番号3のアミノ酸配列のN末端側から3位または48位のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異であることを特徴とする機能強化乳酸菌。

【請求項3】
 
前記第1のアミノ酸配列のN末端側から3位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする請求項1記載の機能強化乳酸菌。

【請求項4】
 
前記第2のアミノ酸配列のN末端側から6位のアミノ酸残基がリシン残基から他のアミノ酸残基に置換されたことを特徴とする請求項1記載の機能強化乳酸菌。

【請求項5】
 
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、アルギニン、トレオニン残基、メチオニン残基のいずれかであることを特徴とする請求項3記載の機能強化乳酸菌。

【請求項6】
 
前記他のアミノ酸残基がアスパラギン残基、グルタミン酸、アルギニンのいずれかであることを特徴とする請求項4記載の機能強化乳酸菌。

【請求項7】
 
前記野生株はラクトバシラス目であることを特徴とする請求項1から請求項6のいずれかに記載の機能強化乳酸菌。

【請求項8】
 
前記変異は生体調節機能を高める変異であることを特徴とする請求項7記載の機能強化乳酸菌。

【請求項9】
 
前記変異はタンパク質生産機能を高める変異であることを特徴とする請求項7記載の機能強化乳酸菌。

【請求項10】
 
前記野生株はラクトバチラス・ラムノサスであることを特徴とする請求項8の記載の機能強化乳酸菌。

【請求項11】
 
前記野生株はラクトコッカス・ラクチスであることを特徴とする請求項9の記載の機能強化乳酸菌。

【請求項12】
 
抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しS12リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列または翻訳後のアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む機能強化乳酸菌の製造方法。

【請求項13】
 
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であることを特徴とする請求項12に記載の機能強化乳酸菌の製造方法。

【請求項14】
 
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であることを特徴とする請求項12に記載の機能強化乳酸菌の製造方法。

【請求項15】
 
抗生物質を含む培地に乳酸菌を培養する工程と、培地上に出現したコロニーに対しS12リボソームタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列もしくはコードされたアミノ酸残基の変異を特定する工程と、前記乳酸菌の機能を確認する工程を含む、乳酸菌の機能強化方法。

【請求項16】
 
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌のプロバイオティクス機能を確認する工程であることを特徴とする請求項15に記載の乳酸菌の機能強化方法。

【請求項17】
 
前記乳酸菌の機能を確認する工程は、前記乳酸菌の組換えタンパク質生産機能を確認する工程であることを特徴とする請求項15に記載の乳酸菌の機能強化方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2018050476thum.jpg
State of application right Published
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