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細胞内移行性DNA及びそれを用いた目的分子の細胞内導入方法 新技術説明会

国内特許コード P180015252
整理番号 (S2015-2057-N0)
掲載日 2018年8月31日
出願番号 特願2017-540003
出願日 平成28年9月16日(2016.9.16)
国際出願番号 JP2016077449
国際公開番号 WO2017047750
国際出願日 平成28年9月16日(2016.9.16)
国際公開日 平成29年3月23日(2017.3.23)
優先権データ
  • 特願2015-185295 (2015.9.18) JP
発明者
  • 立花 亮
  • 田辺 利住
出願人
  • 公立大学法人大阪市立大学
発明の名称 細胞内移行性DNA及びそれを用いた目的分子の細胞内導入方法 新技術説明会
発明の概要 細胞内移行性DNA、該DNAと細胞内に導入しようとする目的分子とを含む組成物、該組成物を用いた目的分子を細胞内に導入する方法、並びに該DNAを含む、目的分子の細胞内導入剤及び細胞内導入用キットの提供。
以下の塩基配列: 5'-N1-N2-GG-N5-N6-N7-GGTGGT-N14-GGGG-N19-N20-G-N22-N23-TCG-N27-N28-N29-G-N31-AT-N34-N35-GTG-N39-N40-TCG-3'[ここで、N1は欠失しているか又はTであり、N2はGであるか又は欠失しており、N5はC又はTであり、N6はG又はCであり、N7はG又はTであり、N14はG又はCであり、N19はA又はGであり、N20はG又はAであり、N22は欠失しているか又はTであり、N23はT又はAであり、N27はG、T又はAであり、N28はT、A又はCであり、N29は欠失しているか又はTであり、N31はG又はAであり、N34はGであるか又は欠失しており、N35はC又はAであり、N39はG又はTであり、かつN40はG又はAである] (配列番号1)からなる細胞内移行領域を含む、細胞内移行性DNA。
従来技術、競合技術の概要


核酸やペプチド若しくはタンパク質などの分子を細胞内に導入する技術は、それらの分子の機能の解明又は疾患の治療若しくは病因解明を含めた様々な目的のために重要である。しかし、一般に、タンパク質や核酸などの分子は親水性が高く、通常、細胞膜をほとんど透過しない。そのため、これらの分子を細胞内に導入する技術が多く開発されている。



例えば、核酸を細胞内に導入する技術としては、電気的に細胞膜に穴を開け核酸を細胞内に取り込ませるエレクトロポレーション法、ガラス毛細管によって核酸を直接注入するマイクロインジェクション法、核酸を取り込んだリポソームを用いるリポフェクション法、レトロウイルスなどのウイルスを利用したウイルスベクター法などが挙げられる。しかし、エレクトロポレーション法及びマイクロインジェクション法は、細胞に物理的に穴を開けて核酸などを導入するため、細胞へのダメージが大きく、また、専用の装置を必要とする。エレクトロポレーション法ではまた、細胞に応じて導入条件の検討が必要となり、手間がかかる。リポフェクション法は、試薬の細胞への毒性が問題となり、また、費用も高い。ウイルスベクター法は、ベクターの調製に時間がかかり、また、目的以外の核酸やタンパク質なども導入される可能性があるという問題がある。すなわち、現在利用可能な技術には、導入効率、細胞毒性、費用、労力、安全性などの点で多くの課題が残されている。



また近年急速に開発が進んでいる核酸医薬も、一般に生体内への導入が困難であり、効率的なドラッグデリバリーシステムの開発が必要である。



細胞膜透過性ペプチド(CPP)と一般に称される細胞内へ移行する性質を有するペプチドを利用した、タンパク質や核酸などの分子の細胞内への導入方法も知られている。代表的な細胞膜透過性ペプチドとしては、HIV-1ウイルス由来のTat、及びショウジョウバエ由来のペネトラチンが挙げられる(特許文献1及び2)。



同様に、細胞内に移行する性質を有するRNAが報告されている(非特許文献1及び特許文献3)。このRNAは、ランダム配列を含むRNAライブラリーから、細胞内に移行したRNAを選択し増幅するサイクルを複数回繰り返すことによって、細胞内移行性RNAのみを選別する方法(Cell SELEX法と称される)によって同定された。しかし、RNAは一般に分解されやすいため、この細胞内移行性RNAを用いて他の分子を細胞内に導入する技術を実用化するには、安定性などの多くの課題がある。

産業上の利用分野


本発明は、細胞内移行性DNAに関する。本発明はまた、該DNAと細胞内に導入しようとする目的分子とを含む組成物、及び該組成物を用いた目的分子を細胞内に導入する方法に関する。さらに本発明は、該DNAを含む、目的分子の細胞内導入剤及び細胞内導入用キットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の塩基配列:
5'-N1-N2-GG-N5-N6-N7-GGTGGT-N14-GGGG-N19-N20-G-N22-N23-TCG-N27-N28-N29-G-N31-AT-N34-N35-GTG-N39-N40-TCG-3'
[ここで、
N1は、欠失しているか又はTであり、
N2は、Gであるか又は欠失しており、
N5は、C又はTであり、
N6は、G又はCであり、
N7は、G又はTであり、
N14は、G又はCであり、
N19は、A又はGであり、
N20は、G又はAであり、
N22は、欠失しているか又はTであり、
N23は、T又はAであり、
N27は、G、T又はAであり、
N28は、T、A又はCであり、
N29は、欠失しているか又はTであり、
N31は、G又はAであり、
N34は、Gであるか又は欠失しており、
N35は、C又はAであり、
N39は、G又はTであり、かつ
N40は、G又はAである] (配列番号1)
からなる細胞内移行領域を含む、細胞内移行性DNA。

【請求項2】
前記塩基配列が、以下の(a)又は(b)である、請求項1に記載の細胞内移行性DNA。
(a) 5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGGTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号2)、
5'-GGTGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGTTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号3)、
5'-GGGCGGGGTGGTCGGGGGAGTTTCGGTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号4)、
5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGTATGGATGCGTGGATCG-3' (配列番号5)、
5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGATGGATCGTGGGTCG-3' (配列番号6)、
5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGGATCGGTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号7)、
5'-GGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGATGGATGAGTGGGTCG-3' (配列番号8)、
5'-GGGCCGGGTGGTGGGGGAGGTTCGGTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号9)、
5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGACGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号10)、
5'-TGGGCGGGGTGGTGGGGGAGGTTCGGTGAATGCGTGTGTCG-3' (配列番号11)、及び
5'-GGGCGTGGTGGTGGGGGAGGTTCGGTGGATGCGTGGGTCG-3' (配列番号12)
のいずれかに示される塩基配列
(b) 配列番号2~12のいずれかに示される塩基配列において、1若しくは2個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【請求項3】
以下の塩基配列:
5'-N1-N2-GG-N5-N6-N7-GGTGGT-N14-GGGG-N19-N20-G-3'
[ここで、
N1は、欠失しているか又はTであり、
N2は、Gであるか又は欠失しており、
N5は、C又はTであり、
N6は、G又はCであり、
N7は、G又はTであり、
N14は、G又はCであり、
N19は、A又はGであり、かつ
N20は、G又はAである] (配列番号13)
を2個以上含む細胞内移行領域を含む、細胞内移行性DNA。

【請求項4】
前記塩基配列のそれぞれが、以下の(a)又は(b)である、請求項3に記載の細胞内移行性DNA。
(a) 5'-GGGCGGGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号14)、
5'-GGTGGGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号15)、
5'-GGGCGGGGTGGTCGGGGGAG-3' (配列番号16)、
5'-GGCGGGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号17)、
5'-GGGCCGGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号18)、
5'-TGGGCGGGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号19)、及び
5'-GGGCGTGGTGGTGGGGGAGG-3' (配列番号20)
のいずれかに示される塩基配列
(b) 配列番号14~20のいずれかに示される塩基配列において、1個の塩基が置換、欠失、挿入又は付加された塩基配列

【請求項5】
2個以上の細胞内移行性DNAが結合してなる、細胞内移行性DNAの多量体であって、該細胞内移行性DNAのそれぞれは、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞内移行性DNAから選択される、細胞内移行性DNA多量体。

【請求項6】
請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞内移行性DNA又は請求項5に記載の細胞内移行性DNA多量体を含む、目的分子の細胞内導入剤。

【請求項7】
請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞内移行性DNA又は請求項5に記載の細胞内移行性DNA多量体と、細胞内に導入しようとする目的分子とを含む、組成物。

【請求項8】
目的分子を細胞内に導入する方法であって、請求項7に記載の組成物を細胞と接触させることを含む、方法。

【請求項9】
請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞内移行性DNA又は請求項5に記載の細胞内移行性DNA多量体を含む、目的分子の細胞内導入用キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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