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(In Japanese)キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法

Patent code P180015296
File No. (S2016-0025-N0)
Posted date Sep 25, 2018
Application number P2017-544248
Date of filing Oct 7, 2016
International application number JP2016079989
International publication number WO2017061615
Date of international filing Oct 7, 2016
Date of international publication Apr 13, 2017
Priority data
  • P2015-200458 (Oct 8, 2015) JP
Inventor
  • (In Japanese)西尾 信博
  • (In Japanese)中沢 洋三
  • (In Japanese)田中 美幸
  • (In Japanese)盛田 大介
  • (In Japanese)▲高▼橋 義行
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人名古屋大学
  • (In Japanese)国立大学法人信州大学
Title (In Japanese)キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法
Abstract (In Japanese)トランスポゾン法を利用したCAR療法における遺伝子導入効率の向上を図る。(1)T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ;(2)トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ;(3)ステップ(1)で用意した非増殖性細胞とステップ(2)で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ;(4)培養後の細胞を回収するステップを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法が提供される。また、(i)T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ;(ii)トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ;(iii)ステップ(i)で用意した非増殖性細胞とステップ(ii)で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ;(iv)培養後の細胞を回収するステップを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法が提供される。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

キメラ抗原受容体(Chimeric Antigen Receptor。以下、「CAR」とも呼ぶ)を用いた遺伝子改変T細胞療法(CAR療法)が臨床応用されつつある。CARは、典型的には、抗体の単鎖可変領域を細胞外ドメインとし、それに膜貫通領域、CD3ζ及び共刺激シグナルを伝える分子の細胞内ドメインをつないだ構造を備える。抗体の特異性に従って抗原に結合することによりCAR-T細胞は活性化し、標的細胞(がん細胞など)を傷害する。CAR療法は、細胞の調製が比較的容易であること、高い細胞傷害活性を示すこと、持続的な効果を期待できることなどの利点を有し、特に、難治性や従来の治療法に抵抗性の症例に対する新たな治療手段として期待されている。実際、化学療法抵抗性急性リンパ性白血病(acute lymphoblastic leukemia)患者に対して、細胞表面に発現するCD19抗原に対するCARを、患者から採取した末梢血T細胞に遺伝子導入し、培養して輸注する臨床試験が欧米で行われ、寛解率80~90%の良好な成績が報告されている(非特許文献1~3)。CAR療法は、米国では難治性がんに対して最も将来有望な治療法の1つとして注目されている。

従来、CAR療法に用いる細胞(CAR-T細胞)はウイルスベクターを用いて調製されてきた。しかしながら、一般に使用されるレトロウイルスは、がん原遺伝子への挿入変異の頻度が高く(造血幹細胞を用いた遺伝子治療では白血病が多発している)、安全性が問題となる。また、従来法では細胞株や牛胎児血清を培養に用いており、特に小児患者においては長期安全性が懸念される。更には、ウイルスベクターを使用する際には専用細胞培養設備が必要となるため、治療費が非常に高額となるという、経済性の問題もある(非特許文献4)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明はキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法及びその用途に関する。本出願は、2015年10月8日に出願された日本国特許出願第2015-200458号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下のステップ(1)~(4)を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法:
(1)T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる非増殖性細胞を用意するステップ;
(2)トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ;
(3)ステップ(1)で用意した非増殖性細胞とステップ(2)で得た遺伝子改変T細胞を混合し、抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激しつつ共培養するステップ;
(4)培養後の細胞を回収するステップ。

【請求項2】
 
ステップ(3)とステップ(4)の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、請求項1に記載の調製方法。

【請求項3】
 
ステップ(3)の共培養の期間が1日~14日である、請求項1又は2に記載の調製方法。

【請求項4】
 
ステップ(3)を、T細胞増殖因子の存在下で行う、請求項1~3のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項5】
 
T細胞増殖因子がIL-15である、請求項4に記載の調製方法。

【請求項6】
 
T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、請求項4に記載の調製方法。

【請求項7】
 
以下のステップ(i)~(iv)を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞の調製方法:
(i)T細胞を含む細胞集団を抗CD3抗体及び抗CD28抗体で刺激した後、ウイルスペプチド抗原存在下での培養及び増殖能を喪失させる処理を行うことによって得られる、ウイルスペプチド抗原を保持した非増殖性細胞を用意するステップ;
(ii)トランスポゾン法によって、標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子が導入された遺伝子改変T細胞を得るステップ;
(iii)ステップ(i)で用意した非増殖性細胞とステップ(ii)で得た遺伝子改変T細胞を混合し、共培養するステップ;
(iv)培養後の細胞を回収するステップ。

【請求項8】
 
ステップ(iii)とステップ(iv)の間に、共培養後の細胞をT細胞増殖因子の存在下で培養するステップを行う、請求項7に記載の調製方法。

【請求項9】
 
ステップ(iii)の共培養の期間が1日~14日である、請求項7又は8に記載の調製方法。

【請求項10】
 
ステップ(iii)を、T細胞増殖因子の存在下で行う、請求項7~9のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項11】
 
T細胞増殖因子がIL-15である、請求項10に記載の調製方法。

【請求項12】
 
T細胞増殖因子としてIL-15とIL-7を併用する、請求項10に記載の調製方法。

【請求項13】
 
T細胞を含む細胞集団が末梢血単核細胞(PBMCs)である、請求項1~12のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項14】
 
増殖能を喪失させる処理が放射線照射である、請求項1~13のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項15】
 
トランスポゾン法がPiggyBacトランスポゾン法である、請求項1~14のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項16】
 
標的抗原がCD19、CD19、GD2、GMCSF受容体又はIGF受容体である、請求項1~15のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項17】
 
非増殖性細胞と、遺伝子改変T細胞が同一の個体に由来する、請求項1~16のいずれか一項に記載の調製方法。

【請求項18】
 
請求項1~17のいずれか一項に記載の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変T細胞。

【請求項19】
 
請求項18に記載の遺伝子改変T細胞を治療上有効量含む、細胞製剤。

【請求項20】
 
請求項18に記載の遺伝子改変T細胞を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2017544248thum.jpg
State of application right Published
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