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筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 NEW

国内特許コード P180015301
整理番号 (S2016-0028-N0)
掲載日 2018年9月25日
出願番号 特願2017-548781
出願日 平成28年11月1日(2016.11.1)
国際出願番号 JP2016082490
国際公開番号 WO2017078029
国際出願日 平成28年11月1日(2016.11.1)
国際公開日 平成29年5月11日(2017.5.11)
優先権データ
  • 特願2015-216609 (2015.11.4) JP
発明者
  • 赤澤 智宏
  • 鈴木 喜晴
  • 馬渕 洋
  • 石井 佳菜
  • 関矢 一郎
  • 関口 清俊
出願人
  • 国立大学法人 東京医科歯科大学
  • 国立大学法人大阪大学
発明の名称 筋衛星細胞培養用材料および筋衛星細胞の培養方法 NEW
発明の概要 未分化性を維持したまま増殖させる筋衛星細胞の培養用材料及びこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。本発明は、ラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料、およびこれを用いた筋衛星細胞の培養方法に関する。
従来技術、競合技術の概要


骨格筋の組織幹細胞である筋衛星細胞は、筋繊維と基底膜との間隙に存在し、通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持している。しかし、ひとたび筋が損傷を受けると筋衛星細胞は活性化され、増殖と分化を経て筋組織を修復・再生する。加齢と共に筋衛星細胞の数及び機能が低下することが知られており、そのことにより筋繊維の損傷や萎縮に対して脆弱となった結果、筋量・筋力の低下へと繋がり、サルコペニアを発症すると考えられている(非特許文献1参照)。このような筋衛星細胞の機能不全による筋疾患や筋萎縮、または筋ジストロフィーなどの遺伝性筋疾患の新たな治療法として、局所に筋衛星細胞を移植して筋機能を再生することを目指した細胞移植治療の研究が注目されている。iPS細胞から分化誘導する方法が試みられているが、安全性・品質を満たす筋衛星細胞は得られていない。一方、生体組織から得られる筋衛星細胞はわずかであり、移植治療に十分な量を確保するためには、in vitroで培養して細胞数を増やさなくてはならない。現在、筋衛星細胞の培養には、培養ディッシュ上にコートする接着基質としてマトリゲル(商品名)が汎用されている(非特許文献2参照)。しかしマトリゲルは、マウスEngelbreth-Holm-Swarm腫瘍由来の構成成分未知な蛋白質混合ゲルであるため、ヒト移植治療用の細胞の培養基質としては適さない。



前述したように、静止期筋衛星細胞は筋繊維と基底膜に挟まれるように存在している。基底膜の主要構成蛋白質の一つにラミニンがある。ラミニンは、α、β、γ鎖の3つのサブユニットから構成されているヘテロ三量体蛋白質で、α、β、γ鎖の組合せによって15種類のラミニンアイソフォームが同定されている。特にラミニンα鎖は組織特異的・発生段階特異的に発現していることが知られている。ラミニンの細胞接着活性を介する細胞表面レセプターはいくつか同定されているが、その主たるものはインテグリン(α6β1、α7β1、α6β4など)である。ラミニンは、各々サブユニット鎖の分子量がいずれも200~400kDと巨大で、それらを組換え蛋白質として発現・会合させヘテロ三量体蛋白質として精製することは容易ではない。



そこで、ラミニンのインテグリン結合活性を保持した最小単位として組換えE8フラグメントが作成され、ゼノフリー条件での大量発現・精製が可能となっている。さらに、主たるラミニンアイソフォーム[ラミニン-111(α1β1γ1)、ラミニン-211(α2β1γ1)、ラミニン-332(α3β3γ2)、ラミニン-411(α4β1γ1)、ラミニン-511(α5β1γ1)]の組換えE8フラグメントが調製され、ES細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞の未分化維持培養法において、ラミニン-511またはラミニン-332のE8フラグメントが効果的であることが見出されている(特許文献1参照)。

産業上の利用分野


本発明は、ラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用材料、これを用いた筋衛星細胞の培養方法および筋衛星細胞培養用キット等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
第1のラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料。

【請求項2】
筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地である、請求項1記載の筋衛星細胞培養用材料。

【請求項3】
第1のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材である、請求項1または2記載の筋衛星細胞培養用材料。

【請求項4】
前記第1のラミニンが、ヒトラミニンのE8フラグメントを含むことを特徴とする請求項1~3のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。

【請求項5】
前記第1のラミニンが、ヒトラミニンα2β1γ1、ヒトラミニンα3β3γ2、ヒトラミニンα4β1γ1およびヒトラミニンα5β1γ1から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする請求項1~4のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。

【請求項6】
前記第1のラミニンが、ヒトラミニンα2β1γ1のE8フラグメントを含むことを特徴とする請求項1~5のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。

【請求項7】
筋衛星細胞と第1のラミニンとを接触させる接触工程を含む、筋衛星細胞の培養方法。

【請求項8】
第1のラミニンが、
a)培地に含まれている;
b)培養基材中に含まれている;または
c)培養基材にコーティングされている
ことを特徴とする、請求項7記載の筋衛星細胞の培養方法。

【請求項9】
培養基材が、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、またはコラーゲンスポンジであることを特徴とする、請求項8記載の筋衛星細胞の培養方法。

【請求項10】
前記接触工程において、請求項1~6のいずれか一項に記載の培養用材料を用いることを特徴とする、請求項7に記載の筋衛星細胞の培養方法。

【請求項11】
さらに、筋衛星細胞と第2のラミニンとを接触させる接触工程を含む、請求項7~10のいずれか一項記載の筋衛星細胞の培養方法。

【請求項12】
前記第2のラミニンが、ヒトラミニンα3β3γ2、ヒトラミニンα4β1γ1およびヒトラミニンα5β1γ1から成る群より選択される少なくとも1種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、請求項11に記載の培養方法。

【請求項13】
前記第2のラミニンが、ヒトラミニンのE8フラグメントを含むことを特徴とする、請求項11または12に記載の培養方法。

【請求項14】
前記第2のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、請求項11~13のいずれか一項記載の培養方法。

【請求項15】
前記筋衛星細胞と第2のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、請求項11~14のいずれか一項記載の培養方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
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