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NUCLEIC ACID APTAMER, SOLID PHASE CARRIER, HUMAN IgG PURIFICATION COLUMN, AND HUMAN IgG PURIFICATION METHOD

Patent code P180015373
File No. S2017-0241-N0
Posted date Nov 1, 2018
Application number P2017-023175
Publication number P2018-126117A
Date of filing Feb 10, 2017
Date of publication of application Aug 16, 2018
Inventor
  • (In Japanese)山岸 賢司
  • (In Japanese)関口 真裕
  • (In Japanese)吉田 尚恵
  • (In Japanese)坂本 泰一
  • (In Japanese)野村 祐介
  • (In Japanese)石川 岳志
Applicant
  • (In Japanese)学校法人日本大学
Title NUCLEIC ACID APTAMER, SOLID PHASE CARRIER, HUMAN IgG PURIFICATION COLUMN, AND HUMAN IgG PURIFICATION METHOD
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a nucleic acid aptamer with increased affinity for human IgG.
SOLUTION: A nucleic acid aptamer having a potential secondary structure selected from structures represented by formulas (I) to (III) and having binding activity to human IgG. (N1 to N5 are A, G, C, U or T, N2 and N3, N4 and N5 are complementary; (i) GGUG(C/A)(U/T)(excluding the third U), (ii) N1 and C in AN1C, (iii) N2 to N5 independently denote ribonucleotide residues, deoxyribonucleotide residues, 2'-O-Me ribonucleotide residues and the like; the third U of (i) is a 2'-fluororibonucleotide residue; A of (ii) is a sugar-modified nucleotide residue).
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

IgGは血清の主要なタンパク質の1つで、免疫系において異物を認識し排除に導くという重要な役割を担っている。この特性を活かして各種疾患の治療薬や診断薬、また試薬への応用研究が広くおこなわれている。またIgGは、抗原と特異的に結合する性質を利用して、免疫学的測定をはじめ、細胞やタンパク質の機能解析、遺伝子の発現スクリーニングなど各種生化学実験の必須の道具として使われている。

IgGは2本のH鎖と2本のL鎖がジスルフィド結合(S-S結合)で結合したY字形の構造をしている。IgGをタンパク質分解酵素であるパパインで分解すると、定常部位からなるFcフラグメントと抗原結合部位を含むFabフラグメントに分けることができる。また、IgGにはサブクラスが存在し、ヒトIgGの場合はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4の4種類が存在する。

IgGは、血清やハイブリドーマ細胞培養上清液から、抗体精製用カラムを用いて精製される。一般に、第一段階の精製にはリガンドとしてProtein Aが使用される。Protein Aは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)が産生する分子量42kDaのタンパク質で、IgGのFc領域に強く結合する。しかしながら、Protein Aは高価であり、またProtein Aを用いた精製条件ではIgGが変性する場合もあるため、Protein Aの性能を上回る新規のIgG用分離剤が求められている。

一方、核酸アプタマーは、特異的に標的物質に結合する能力を持った核酸分子である。核酸アプタマーは、抗体に代わる、抗原と特異的に結合する分子として注目されており、医薬、診断薬、試薬等への応用が期待されている。ヒトIgGに対する結合活性を有する核酸アプタマーも報告されており(特許文献1)、ヒトIgGの精製、標識化、薬物結合リンカー等への応用が想定されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、核酸アプタマー、固相担体、ヒトIgG精製用カラム、及びヒトIgGの精製方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記一般式(I)~(III)からなる群より選択される潜在的二次構造を有する、ヒトIgGに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
【化1】
 
(省略)
[式中、N1~N5は、それぞれ独立に、A、G、C、U及びTからなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
N2及びN3は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
N4及びN5は、互いに相補的なヌクレオチド残基であり、
(i)GGUG(C/A)(U/T)における各ヌクレオチド残基(但し、3番目のUを除く)、(ii)AN1CにおけるN1及びC、並びに(iii)N2~N5の各ヌクレオチド残基は、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、2’-フルオロリボヌクレオチド残基、及び2’-O-Meリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基であり、
GGUG(C/A)(U/T)における3番目のUは、2’-フルオロリボヌクレオチド残基であり、
AN1CにおけるAは、糖修飾ヌクレオチド残基である。
実線は、A、G、C、U及びTからなる群より選択されるヌクレオチド残基が任意の長さで連結していることを示し、破線は、相補的な結合(塩基対合)能を潜在的に有することを示す。]

【請求項2】
 
前記一般式(I)~(III)において、GGUG(C/A)(U/T)が、GGUGCUである、請求項1に記載の核酸アプタマー。

【請求項3】
 
以下の(a)及び(b)からなる群より選択される、核酸アプタマー。
(a)配列番号11に記載のヌクレオチド配列において、18位のAが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトIgGに対して結合活性を有する核酸アプタマー。
(b)配列番号11に記載のヌクレオチド配列において、18位のAが糖修飾ヌクレオチド残基で置換されており、18位のA以外の1個又は複数個のヌクレオチド残基が、それぞれ独立に、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基、2’-フルオロリボヌクレオチド残基、及び2’-O-Meリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基で置換されている配列からなる、ヒトIgGに対して結合活性を有する核酸アプタマー。

【請求項4】
 
前記糖修飾ヌクレオチド残基が、LNA残基、及び2’-O-MCEリボヌクレオチド残基からなる群より選択されるヌクレオチド残基である、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸アプタマーが固定化された固相担体。

【請求項6】
 
請求項5に記載の固相担体を含む、ヒトIgG精製用カラム。

【請求項7】
 
請求項5に記載の固相担体にヒトIgGを吸着させ、前記の吸着したヒトIgGを溶出液により溶出させることを含む、ヒトIgGの精製方法。

【請求項8】
 
1個又は複数個の機能性物質が結合した、請求項1~4のいずれか一項に記載の核酸アプタマー。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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