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METHOD FOR CULTURING MULTIPOTENT STEM CELL AND BASE MATERIAL FOR THE SAME achieved

Patent code P180015507
File No. 3701
Posted date Nov 21, 2018
Application number P2012-127580
Publication number P2013-247943A
Patent number P6024047
Date of filing Jun 4, 2012
Date of publication of application Dec 12, 2013
Date of registration Oct 21, 2016
Inventor
  • (In Japanese)陳 勇
  • (In Japanese)亀井 謙一郎
  • (In Japanese)劉 莉
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人京都大学
Title METHOD FOR CULTURING MULTIPOTENT STEM CELL AND BASE MATERIAL FOR THE SAME achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a stable culture system of human multipotent stem cells inexpensively.
SOLUTION: A base material for cultivation of multipotent stem cells for maintenance and amplification includes a nanofiber comprising a biopolymer selected from the group consisting of gelatine, collagen and cellulose. A method of maintenance and amplification of multipotent stem cells includes sowing the multipotent stem cells on the base material; and statically culturing the cells. The method includes: dissociating the multipotent stem cell from the base material using dissociation solution not containing enzyme; sowing the cells on the other culture base material; and further statically culturing the cells. Especially, the method includes dispersing the multipotent stem cells upto single cell at the time of passage.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

ヒト多能性幹細胞は適切な条件下において無制限に増殖が可能であり、また生体組織のどの細胞にも分化できる性質(多分化能)を持つことから、細胞移植治療・創薬スクリーニング・再生医療など様々な分野への応用が期待されている。しかし、従来のヒト多能性幹細胞の培養法では、フィーダー細胞や各種高分子などを細胞培養基材として用いてきたが、これらの方法は準備操作が煩雑であり、また品質が安定していないため、安定したヒト多能性幹細胞の培養・供給は困難であった。特に、ヒト多能性幹細胞の高品質・大量・全自動培養法の開発には、より安定・安価な方法が必要であるが、未だにそのような方法は確立されていない。

近年、フィーダー細胞を用いない新規ヒト多能性幹細胞培養法の開発が盛んに行われている。現在、広く使用されている細胞培養基材としては、マトリゲルや組換えタンパク質(非特許文献1)等が挙げられるが、これらの材料はコストが高く、また、ロット間による品質の差が大きいなど安定性に欠けている。このような条件で培養されたヒト多能性幹細胞は不安定な状態になり、その結果、細胞増殖速度の異常、非常に不均一な細胞群への変質、分化能の損失、核型の変異等の異常を引き起こしてしまう。
これに代わるものとして、ポリマーなどの高分子を用いた細胞培養基材の開発も報告され(非特許文献2、3)、製品化されるようになってきたが、安定した製品は得られるものの、やはり非常に高価であり、また細胞株によっては適さない場合もあるなど、安定・安価な細胞培養基材を作製するには至っていない。

細胞培養基材は、目的の細胞群に必要な酸素と栄養を供給し、しかも安定的な形状を保持することが条件であるが、そこでナノファイバーが注目されている。ナノファイバーは、繊維径がナノメートルのオーダーの極細繊維であり、ナノファイバーからなる構造体は細胞外マトリクスと近似したサイズであり、比表面積の増大により細胞接着性が向上する、三次元培養が可能となる等の利点があることから、合成ポリマー(非特許文献4)や合成ポリマーとコラーゲンやゼラチン等の生体高分子との混合物(非特許文献4、5)からなるナノファイバーが作製されているが、フィーダー細胞を用いない培養系では、ヒトES細胞を維持増殖することができないと報告されている(非特許文献5)。
一方、生体高分子のみからなるナノファイバーを多能性幹細胞の培養用基材として用いたという報告は皆無である。

また、従来、ヒト多能性幹細胞の継代には、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、等の酵素を用いた手法か、セルストレイナーやピペッティング等による機械的継代方法が行われてきたが、酵素を用いた手法では、酵素反応による細胞へのダメージがあり、また細胞に対する酵素反応が不均一である。単一細胞まで分散させると細胞が死滅してしまうといった問題点がある。一方、機械的な継代方法は、やはり細胞のダメージが非常に大きく、問題点が多い。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、胚性幹細胞(ES細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)などの多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞の培養に適した培養基材、並びにそれを用いた多能性幹細胞の培養方法に関する。より詳細には、本発明は、ゼラチン、コラーゲン、セルロース等の生体高分子からなるナノファイバー(バイオナノファイバー)を用いた多能性幹細胞の培養用基材、並びにそれを用いて、継代時、酵素処理を行うことなく単一細胞にまで分散させることによる、多能性幹細胞の維持増幅方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
分子量30-40kDaのゼラチンからなる、架橋処理されたナノファイバーを含有してなる、多能性幹細胞の維持増幅培養用基材。

【請求項2】
 
ナノファイバーがエレクトロスピニング法により得られる、請求項1記載の基材。

【請求項3】
 
多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項1又は2記載の基材。

【請求項4】
 
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項1~3のいずれかの1項に記載の基材。

【請求項5】
 
請求項1又は2記載の基材上に多能性幹細胞を播種し、該細胞を静置培養することを特徴とする、多能性幹細胞の維持増幅方法。

【請求項6】
 
酵素を含まない解離液を用いて基材から多能性幹細胞を解離させ、該細胞を請求項1又は2記載の基材上に播種し、該細胞をさらに静置培養することを特徴とする、請求項5記載の方法。

【請求項7】
 
継代時に、多能性幹細胞を単一細胞にまで分散させることを特徴とする、請求項6記載の方法。

【請求項8】
 
多能性幹細胞を無血清培地で培養することを特徴とする、請求項57のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
 
無血清培地がxenoフリー培地である、請求項8記載の方法。

【請求項10】
 
無血清培地がタンパク質不含培地である、請求項8記載の方法。

【請求項11】
 
多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項510のいずれか1項に記載の方法。

【請求項12】
 
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項511のいずれか1項に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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