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内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス NEW 外国出願あり

国内特許コード P180015620
整理番号 4783
掲載日 2018年11月22日
出願番号 特願2016-566412
出願日 平成27年12月22日(2015.12.22)
国際出願番号 JP2015085894
国際公開番号 WO2016104541
国際出願日 平成27年12月22日(2015.12.22)
国際公開日 平成28年6月30日(2016.6.30)
優先権データ
  • 特願2014-261088 (2014.12.24) JP
発明者
  • 亀井 謙一郎
  • 本田 桃子
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイス NEW 外国出願あり
発明の概要 分散された多能性細胞からも内胚葉系細胞を誘導でき、且つ内胚葉系細胞の作製効率が向上した内胚葉系細胞の製造方法を提供する。
本発明の内胚葉系細胞の製造方法は、多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、また、前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が、0.5×10~2×10細胞/cmであることが好ましい。
従来技術、競合技術の概要


薬剤の機能評価等を行うために、ES細胞(胚性幹細胞、embryonic stem cells)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells、iPS細胞)等の多能性細胞から肝臓様細胞(以下、「肝臓細胞」ともいう。)を分化させることが試みられている。前記多能性細胞から前記肝臓細胞を誘導する方法として、肝臓細胞分化に関与する遺伝子を前記多能性細胞に導入する方法が知られている。また、非特許文献1には、細胞塊を形成した前記多能性細胞から前記肝臓細胞を誘導する方法が開示されている。



しかしながら、遺伝子導入では、例えば、導入後の細胞のがん化等の可能性が懸念される。また、前記非特許文献1の方法では、分化の初期段階で大半の細胞が死ぬという問題や、前記肝臓細胞の誘導に適した均一な細胞塊を作製するのが困難という問題があった。

産業上の利用分野


本発明は、内胚葉系細胞の製造方法、肝臓細胞の製造方法、膵臓細胞の製造方法、内胚葉系細胞の誘導促進剤、肝臓細胞の誘導促進キット、膵臓細胞の誘導促進キット、およびマイクロ流体デバイスに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
多能性細胞から内胚葉系細胞を誘導することにより前記内胚葉系細胞を製造する方法であって、
内胚葉系細胞誘導因子の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程を含み、
前記誘導工程において、ROCKタンパク質の活性を抑制することを特徴とする、内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項2】
前記誘導工程において、前記誘導開始時の前記多能性細胞の細胞密度が、0.5×10~2×10細胞/cmである、請求項1記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項3】
前記多能性細胞が、分散された多能性細胞である、請求項1または2記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項4】
前記内胚葉系細胞誘導因子が、TGF-βファミリータンパク質、bFGF、PIKタンパク質の活性抑制物質、GSK-3βタンパク質の活性抑制物質、およびmTORタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項5】
前記TGF-βファミリータンパク質が、アクチビン、BMP-4、およびNODALからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項4記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項6】
前記誘導工程が、前記内胚葉系細胞誘導因子を含む多能性細胞用の培養液の存在下、前記多能性細胞を前記内胚葉系細胞へ誘導する誘導工程である、請求項1から5のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項7】
前記培養液が、TGF-βファミリータンパク質、bFGF、およびインスリンを含む培養液である、請求項6記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項8】
前記誘導工程において、前記ROCKタンパク質の活性抑制化合物により前記ROCKタンパク質の活性を抑制する、請求項1から7のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法。

【請求項9】
肝臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を肝臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
前記内胚葉系細胞が、請求項1から8のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする、肝臓細胞の製造方法。

【請求項10】
前記肝臓細胞分化因子が、TGF-βファミリータンパク質、FGF10、およびWNTからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項9記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項11】
前記TGF-βファミリータンパク質が、アクチビン、BMP-4、およびNODALからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項10記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項12】
さらに、肝臓細胞成熟因子の存在下、前記肝臓細胞を成熟させる成熟工程を含む、請求項9から11のいずれか一項に記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項13】
前記成熟工程において、足場上で前記肝臓細胞を成熟させる、請求項12記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項14】
前記足場が、細胞外基質タンパク質を含むコーティングである、請求項13記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項15】
前記足場が、血液成分を含むコーティングである、請求項13記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項16】
前記足場が、組み換えタンパク質を含むコーティングである、請求項13記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項17】
前記肝臓細胞成熟因子が、OSM、HGF、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の肝臓細胞の製造方法。

【請求項18】
膵臓細胞分化因子の存在下、内胚葉系細胞を膵臓細胞へ分化させる分化工程を含み、
前記内胚葉系細胞が、請求項1から8のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の製造方法により得られた内胚葉系細胞であることを特徴とする、膵臓細胞の製造方法。

【請求項19】
多能性細胞から内胚葉系細胞の誘導に用いる誘導促進剤であって、
ROCKタンパク質の活性抑制物質を含むことを特徴とする、内胚葉系細胞の誘導促進剤。

【請求項20】
前記ROCKタンパク質の活性抑制物質が、前記ROCKタンパク質の活性抑制化合物である、請求項19記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。

【請求項21】
さらに、内胚葉系細胞誘導因子を含む、請求項19または20記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。

【請求項22】
前記内胚葉系細胞誘導因子が、TGF-βファミリータンパク質、bFGF、PIKタンパク質の活性抑制物質、GSK-3βタンパク質の活性抑制物質、およびmTORタンパク質の活性抑制物質からなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項21記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。

【請求項23】
前記TGF-βファミリータンパク質が、アクチビン、BMP-4、およびNODALからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項22記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤。

【請求項24】
請求項19から23のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする、肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項25】
さらに、肝臓細胞分化因子を含む、請求項24記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項26】
前記肝臓細胞分化因子が、TGF-βファミリータンパク質、FGF10、およびWNTからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項25記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項27】
前記TGF-βファミリータンパク質が、アクチビン、BMP-4、およびNODALからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項26記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項28】
さらに、肝臓細胞成熟因子を含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項29】
前記肝臓細胞成熟因子が、OSM、HGF、デキサメタゾン、ニコチンアミド、ジメチルスルホキシド、および酪酸ナトリウムからなる群から選択された少なくとも1つを含む、請求項28記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項30】
さらに、マイクロ流体デバイスを含み、
前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも2つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
前記細胞培養チャンバー内に前記肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも1つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの前記肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができるマイクロ流体デバイスである、請求項28または29記載の肝臓細胞の誘導促進キット。

【請求項31】
請求項19から23のいずれか一項に記載の内胚葉系細胞の誘導促進剤を含むことを特徴とする、膵臓細胞の誘導促進キット。

【請求項32】
少なくとも2つの開口部と細胞培養チャンバーとを含み、
前記開口部は、前記細胞培養チャンバーと接続され、
前記細胞培養チャンバー内に肝臓細胞と足場とを導入して培養したときに、少なくとも1つの前記開口部から前記細胞培養チャンバーへの肝臓細胞成熟因子の供給を前記細胞培養チャンバー内で濃度勾配を形成しながら行うことができ、
請求項9から17の肝臓細胞の製造方法に使用することを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
国際特許分類(IPC)
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出願権利状態 公開
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