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NRG1の切断検出用プローブ、NRG1の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド、NRG1の切断検出用プローブの発現ベクター、NRG1の切断検出用形質転換体、NRG1の切断検出方法、およびNRG1切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法 NEW

国内特許コード P180015675
整理番号 5315
掲載日 2018年11月22日
出願番号 特願2016-053156
公開番号 特開2017-165688
出願日 平成28年3月16日(2016.3.16)
公開日 平成29年9月21日(2017.9.21)
発明者
  • 瀬原 淳子
  • 亀崎 青沙
  • 佐藤 文規
  • 青木 一洋
  • 川上 浩一
出願人
  • 国立大学法人京都大学
  • 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
発明の名称 NRG1の切断検出用プローブ、NRG1の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド、NRG1の切断検出用プローブの発現ベクター、NRG1の切断検出用形質転換体、NRG1の切断検出方法、およびNRG1切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法 NEW
発明の概要 【課題】 簡便にニューレグリン1タンパク質(NRG1)の切断を検出できる、NRG1の切断検出用プローブを提供する。
【解決手段】 本発明のNRG1の切断検出用プローブは、NRG1、第1の標識物質、および第2の標識物質を含み、
前記NRG1が、N末端からC末端にかけて、N末端側領域、NRG1切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびC末端側領域を、この順序で含み、
前記第1の標識物質と前記第2の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、
前記第1の標識物質が、前記N末端側領域に挿入または付加され、
前記第2の標識物質が、前記C末端側領域に挿入または付加されることを特徴とする。
【選択図】 図1
従来技術、競合技術の概要


ニューレグリン1(Neuregulin 1、NRG1)は心臓、脳等の形成や再生、乳腺の発達等に関与していることが知られており、また、BACE1(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1)等のプロテアーゼにより切断されることで活性化する。NRG1の切断制御機構は、アルツハイマー病の原因タンパク質であると考えられているアミロイド前駆タンパク質の切断制御機構と類似していることが知られているが、その切断制御機構は未だ解明されていない部分が多い。このため、NRG1の切断制御機構の解明が望まれている。

産業上の利用分野


本発明は、NRG1の切断検出用プローブ、NRG1の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド、NRG1の切断検出用プローブの発現ベクター、NRG1の切断検出用形質転換体、NRG1の切断検出方法、およびNRG1切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
ニューレグリン1タンパク質(NRG1)、第1の標識物質、および第2の標識物質を含み、
前記NRG1が、N末端からC末端にかけて、N末端側領域、NRG1切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびC末端側領域を、この順序で含み、
前記第1の標識物質と前記第2の標識物質とが、異なるシグナルを発する標識物質であり、
前記第1の標識物質が、前記N末端側領域に挿入または付加され、
前記第2の標識物質が、前記C末端側領域に挿入または付加されたタンパク質であることを特徴とする、NRG1の切断検出用プローブ。

【請求項2】
前記第1の標識物質および前記第2の標識物質が、それぞれ、第1の蛍光タンパク質および第2の蛍光タンパク質であり、
前記異なるシグナルを発する標識物質が、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質である、請求項1記載の検出用プローブ。

【請求項3】
前記N末端側領域が、N末端からC末端にかけて、シグナル配列領域、アイソフォーム特異的領域、およびEGF様領域を、この順序で含み、
前記第1の標識物質が、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記EGF様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記シグナル配列領域のN末端に付加される、請求項1または2記載の検出用プローブ。

【請求項4】
前記C末端側領域が、N末端からC末端にかけて、膜貫通領域および細胞質領域を、この順序で含み、
前記第2の標識物質が、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記細胞質領域のC末端に付加される、請求項1から3のいずれか一項に記載の検出用プローブ。

【請求項5】
前記NRG1が、下記(N1Hu)のタンパク質である、請求項1から4のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
(N1Hu)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項6】
前記NRG1が、下記(N1Ze)のタンパク質である、請求項1から4のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
(N1Ze)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項7】
前記検出用プローブが、下記(P1Ze)のタンパク質である、請求項1から4および6のいずれか一項に記載の検出用プローブ。
(P1Ze)配列番号3、4、5、および17のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項8】
ニューレグリン1タンパク質(NRG1)、第1の蛍光タンパク質、および第2の蛍光タンパク質を含み、
前記NRG1が、N末端からC末端にかけて、N末端側領域、NRG1切断酵素により認識され、切断される切断領域、およびC末端側領域を、この順序で含み、
前記第1の蛍光タンパク質と前記第2の蛍光タンパク質とが、異なる波長特性を有する蛍光タンパク質であり、
前記第1の蛍光タンパク質が、前記N末端側領域に挿入または付加され、
前記第2の蛍光タンパク質が、前記C末端側領域に挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする、NRG1の切断検出用プローブをコードするポリヌクレオチド。

【請求項9】
前記N末端側領域が、N末端からC末端にかけて、シグナル配列領域、アイソフォーム特異的領域、およびEGF様領域を、この順序で含み、
前記第1の標識物質が、前記シグナル配列領域、前記アイソフォーム特異的領域、前記EGF様領域、および前記切断領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記シグナル配列領域のN末端に付加される、請求項8記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】
前記C末端側領域が、N末端からC末端にかけて、膜貫通領域および細胞質領域を、この順序で含み、
前記第2の標識物質が、前記切断領域、前記膜貫通領域、および前記細胞質領域のいずれかの領域間もしくは領域内に挿入される、または
前記細胞質領域のC末端に付加される、請求項8または9記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】
前記NRG1が、下記(N1Hu)のタンパク質である、請求項8から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(N1Hu)配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項12】
前記NRG1が、下記(N1Ze)のタンパク質である、請求項8から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(N1Ze)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項13】
前記ポリヌクレオチドが、下記(P1Ze)のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項8から10および12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(P1Ze)配列番号3、4、5、および17のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質

【請求項14】
前記ポリヌクレオチドが、下記(p1Ze)のポリヌクレオチドである、請求項8から10、12および13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(p1Ze)配列番号6、7、8、および18のいずれか塩基配列からなるポリヌクレオチド

【請求項15】
請求項8から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、NRG1の切断検出用プローブの発現ベクター。

【請求項16】
請求項8から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、NRG1の切断検出用形質転換体。

【請求項17】
前記形質転換体が、動物または細胞である、請求項16記載の形質転換体。

【請求項18】
前記動物が、ゼブラフィッシュである、請求項17記載の形質転換体。

【請求項19】
請求項1から7のいずれか一項に記載のNRG1の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出することにより、前記NRG1の切断を検出する検出工程を含むことを特徴とする、NRG1の切断検出方法。

【請求項20】
前記発現系における前記検出用プローブの第1の標識物質由来のシグナルおよび第2の標識物質由来のシグナルに基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項19記載の検出方法。

【請求項21】
前記第1の標識物質由来のシグナル量と、前記第2の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項20記載の検出方法。

【請求項22】
前記第1の標識物質および前記第2の標識物質が、それぞれ、第1の蛍光タンパク質および第2の蛍光タンパク質である、請求項19から21のいずれか一項に記載の検出方法。

【請求項23】
被検物質から、ニューレグリン1タンパク質(NRG1)切断酵素による、請求項1から7のいずれか一項に記載のNRG1の切断検出用プローブの切断を抑制する被検物質を、NRG1切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含むことを特徴とする、NRG1切断酵素の阻害剤のスクリーニング方法。

【請求項24】
請求項1から7のいずれか一項に記載のNRG1の切断検出用プローブの発現系を用い、
前記発現系に、前記被検物質を共存させて、前記NRG1切断酵素により前記検出用プローブを切断する切断工程、
前記発現系における前記検出用プローブの切断を検出する検出工程、および
前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも前記検出用プローブの切断量が少ない被検物質を、前記NRG1切断酵素の阻害剤として選択する選択工程を含む、請求項23記載のスクリーニング方法。

【請求項25】
前記発現系における前記検出用プローブの第1の標識物質由来のシグナルおよび第2の標識物質由来のシグナルに基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項24記載のスクリーニング方法。

【請求項26】
前記第1の標識物質由来のシグナル量と、前記第2の標識物質由来のシグナル量との差および比の少なくとも一方に基づき、前記検出用プローブの切断を検出する、請求項25記載のスクリーニング方法。

【請求項27】
前記第1の標識物質および前記第2の標識物質が、それぞれ、第1の蛍光タンパク質および第2の蛍光タンパク質である、請求項23から26のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
国際特許分類(IPC)
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出願権利状態 公開
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