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(In Japanese)免疫原性を有するMDP1の製造方法

Patent code P180015751
File No. S2018-0514-N0
Posted date Dec 26, 2018
Application number P2018-107292
Publication number P2019-208430A
Date of filing Jun 4, 2018
Date of publication of application Dec 12, 2019
Inventor
  • (In Japanese)尾関 百合子
  • (In Japanese)西山 晃史
  • (In Japanese)松本 壮吉
  • (In Japanese)大原 直也
  • (In Japanese)山本 三郎
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人新潟大学
  • (In Japanese)国立大学法人岡山大学
Title (In Japanese)免疫原性を有するMDP1の製造方法
Abstract (In Japanese)
【課題】
 良好な免疫原性を有するMDP1の製造方法を提供する。
【解決手段】
 製造方法は、Mycobacterial DNA-binding Protein 1(MDP1)を製造する方法であって、前記MDP1は、(a)~(c)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、前記MDP1をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する培養工程と、誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のMDP1の発現を誘導する誘導工程と、を含む方法である。(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列;(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列;(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列
【選択図】
 なし
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

世界中で年間に1040万人が新規に結核を発病し、170万人が結核で死亡している(2016年、世界保健機関による統計)。日本では、乳児期に接種したBCGに対する免疫が低下する10代半ばから老年に至る世代の結核発症が問題となっている。世界で唯一の結核ワクチンであるBCGは、小児の結核性髄膜炎や粟粒結核には十分に有効であるが、成人の肺結核に対する効果は限定的である。しかも、成人結核に対するBCGの再接種の有効性は明確でない。

このため、BCGによる免疫効果を増強するために、ヒト結核菌Mycobacterial DNA-binding Protein 1(MDP1)を使用することが提案されている。MDP1は、結核菌感染者診断のための抗原として有望であり、また、アジュバントとしてDNAとの共存でマウスに投与することで抗体価の上昇、感染防御効果を増強することが知られている(例えば、非特許文献1参照)。また、MDP1は、菌体内でDNAと結合するタンパク質であり、抽出が困難である。そのため、比較的効率の良い抽出方法として、例えば、塩酸を用いる方法が用いられている(例えば、特許文献1参照)。

一方、発明者らは、MDP1が細菌では珍しく、長大な天然変性領域を有し、翻訳後修飾の生じるタンパク質であることを明らかにしている(例えば、非特許文献2~5参照)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、免疫原性を有するMDP1の製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
Mycobacterial DNA-binding Protein 1(MDP1)を製造する方法であって、
前記MDP1は、以下の(a)~(c)のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含み、
前記MDP1をコードする遺伝子と、前記遺伝子の上流に作動可能に連結された誘導性プロモーターと、を含むベクターを非病原性の迅速発育型抗酸菌に形質転換し、培養する培養工程と、
誘導物質を添加して、前記迅速発育型抗酸菌のMDP1の発現を誘導する誘導工程と、
を含む製造方法。
(a)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号1に示されるアミノ酸配列において、1個以上数個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列;
(c)配列番号1に示されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列

【請求項2】
 
前記迅速発育型抗酸菌が有するMDP1遺伝子が欠失又は失活している請求項1に記載の製造方法。

【請求項3】
 
前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記MDP1に変性剤を添加する変性工程と、
前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記MDP1を精製する精製工程と、を更に含む請求項1又は2に記載の製造方法。

【請求項4】
 
前記迅速発育型抗酸菌を破砕し、酸を用いて抽出した前記MDP1に変性剤を添加する変性工程と、
前記変性剤を含む緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記MDP1を精製する第1の精製工程と、
前記変性剤を実質的に含まない緩衝液を用いた液体クロマトグラフィーにより、前記MDP1を精製する第2の精製工程と、を更に含む請求項1又は2に記載の製造方法。

【請求項5】
 
前記MDP1はC末端側にタグペプチドを備える請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項6】
 
前記液体クロマトグラフィーは、前記タグペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーである請求項5に記載の製造方法。

【請求項7】
 
前記迅速発育型抗酸菌は、Mycobacterium smegmatisである請求項1~6のいずれか一項に記載の製造方法。

【請求項8】
 
配列番号2に示される塩基配列からなる核酸を含むベクターを含む非病原性の迅速発育型抗酸菌。

【請求項9】
 
前記迅速発育型抗酸菌が有するMDP1遺伝子が欠失又は失活している請求項8に記載の非病原性の迅速発育型抗酸菌。

【請求項10】
 
前記迅速発育型抗酸菌がMycobacterium smegmatisである請求項8又は9に記載の非病原性の迅速発育型抗酸菌。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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