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LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA SEQUENTIALLY COMPRISING TERMINATOR SEQUENCE AND PROMOTER SEQUENCE

Patent code P190015763
File No. H26-057
Posted date Jan 8, 2019
Application number P2015-007674
Publication number P2016-131516A
Date of filing Jan 19, 2015
Date of publication of application Jul 25, 2016
Inventor
  • (In Japanese)中村 美紀子
  • (In Japanese)星田 尚司
  • (In Japanese)赤田 倫治
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title LINEAR DOUBLE-STRANDED DNA SEQUENTIALLY COMPRISING TERMINATOR SEQUENCE AND PROMOTER SEQUENCE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide linear double-stranded DNA capable of expressing RNA derived from a DNA sequence for RNA expression in a cell without connecting a promoter sequence or a terminator sequence to the DNA sequence for RNA expression in advance, and a method for expressing RNA derived from a DNA sequence for RNA expression using such a linear double-stranded DNA.
SOLUTION: A linear double-stranded DNA that sequentially comprises a terminator sequence and a promoter sequence, in which a base number between a base at 3' terminal of the terminator sequence and 5' terminal of the promoter sequence is 0 to 3000 is fabricated. Further, by introducing the linear double-stranded DNA and a DNA sequence for RNA expression into a cell, RNA derived from the DNA sequence for RNA expression is expressed.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

形質転換細胞を作製して該細胞内で目的遺伝子を発現させるには、プロモータ配列と目的遺伝子とターミネータ配列とを順次備えた二本鎖DNAを作製し、かかるDNAコンストラクトを、ベクターを介して細胞に導入する方法が一般的である。この方法を用いる場合には、プロモータ配列と目的遺伝子とターミネータ配列とを順次備えるようにDNAを連結する必要がある。上記のようにDNAを連結するために最も一般的に用いられている手法は、DNAリガーゼを用いて、平滑末端を有するDNA分子同士又は相補的な突出末端を有するDNA分子同士を結合させるものである。しかしながら、かかる方法は、制限酵素処理とDNAリガーゼによるインサートDNAとベクターの切断並びに連結という複雑なin vitro操作を必要としていた。

近年、本発明者らは、ベクターを介さずに形質転換細胞を作製する方法として、特定のターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマーを用いて作製した、プロモータ配列と目的RNA発現用DNA配列と特定ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAを動物細胞に導入する方法を提案した(特許文献1参照)。かかる方法では、制限酵素サイトやアニーリング配列を導入することなく、また煩雑な環状化操作を行うこともなく、PCRのみによってターミネータ配列をRNA発現用DNA配列の下流に連結でき、得られた線状二本鎖DNAを動物細胞に導入することでRNA発現用DNA配列由来のRNAを発現させることが可能となる。しかしながら、PCRを行う際は、プロモータ配列と目的RNA発現用DNA配列とを順次備えたテンプレートを予め用意する必要があった。

また、本発明者らは、ターミネータ配列とプロモータ配列とRNA発現用DNA配列とを順次備えたRNA発現用線状二本鎖DNAやRNA発現用DNA配列とターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えたRNA発現用線状二本鎖DNA(特許文献2参照)を提案した。かかるRNA発現用線状二本鎖DNAを用いれば、線状二本鎖DNAをそのまま細胞内に導入し、細胞内で容易にRNA発現用DNA配列由来のRNAを発現させることができるが、RNA発現用DNA配列にターミネータ配列又はプロモータ配列を予め連結する必要があった。

さらに、本発明者らは、プロモータ配列からなる線状二本鎖DNA、及び、RNA発現用DNA配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAを細胞内に導入し、前記RNA発現用DNA配列由来のRNAを発現させる形質転換細胞の製造方法を提案した(特許文献3参照)。かかる方法では、予めRNA発現用DNA配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAを調製する必要があり、様々なRNA発現用DNA配列の発現を解析する場合には煩雑な作業と時間が必要であった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAや、かかる線状二本鎖DNAを用いてRNA発現用DNA配列由来のRNAを発現させる方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ターミネータ配列とプロモータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNAであって、ターミネータ配列の3’末端の塩基とプロモータ配列の5’末端との間の塩基数が0~3000であることを特徴とする線状二本鎖DNA。

【請求項2】
 
プラスミドの複製開始点を含まないことを特徴とする請求項1記載の線状二本鎖DNA。

【請求項3】
 
ターミネータ配列が、SV40ターミネータ又はラビットβ-グロビンターミネータ由来の配列であることを特徴とする請求項1又は2記載の線状二本鎖DNA。

【請求項4】
 
プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモータ配列であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の線状二本鎖DNA。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれか記載の線状二本鎖DNA、及び、RNA発現用DNA配列を細胞内に導入することを特徴とする前記RNA発現用DNA配列由来のRNAを発現させる方法。

【請求項6】
 
細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項5記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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