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単鎖抗体のスクリーニング方法及び単鎖抗体 NEW

国内特許コード P190015795
整理番号 (S2016-0105-N0)
掲載日 2019年1月24日
出願番号 特願2017-550314
出願日 平成28年11月7日(2016.11.7)
国際出願番号 JP2016082988
国際公開番号 WO2017082214
国際出願日 平成28年11月7日(2016.11.7)
国際公開日 平成29年5月18日(2017.5.18)
優先権データ
  • 特願2015-219765 (2015.11.9) JP
  • 特願2016-024016 (2016.2.10) JP
発明者
  • 熊田 陽一
  • 長谷川 祐也
  • 内村 誠一
出願人
  • 国立大学法人京都工芸繊維大学
発明の名称 単鎖抗体のスクリーニング方法及び単鎖抗体 NEW
発明の概要 本発明の課題は、分離効率に優れ、抗原との結合能が極めて大きい単鎖抗体のスクリーニング方法の提供、及び、該スクリーニング法により取得された単鎖抗体の提供である。該課題を、多重膜リポソームに結合した抗原を準備する工程、単鎖抗体を提示するファージライブラリを準備する工程、及び前記ファージライブラリから、前記多重膜リポソームに結合した抗原に結合する単鎖抗体を提示するファージを選択する工程を含む、抗原に結合する単鎖抗体のスクリーニング方法により解決する。
従来技術、競合技術の概要


分子標的薬の形態として、抗体医薬品、低分子医薬品をはじめとし、ペプチド医薬品、サイトカインなどの生体内タンパク製剤のほか、siRNA、アプタマーなど、様々なものが研究・開発されている(例えば、特許文献1)。治療薬としての抗体の使用は、その特異性から、疾患細胞が特異的抗原を発現する病態の治療に有用である。抗体は、細胞表面に発現するタンパク質を抗原として結合し、結合した細胞に有効に作用する。抗体は、血中半減期が長く、抗原への特異性が高いという特徴を持ち、抗腫瘍剤としても非常に有用である。



このような抗体の取得方法として、抗体ライブラリを用いたパニング(「砂の中から砂金を洗い出すこと」になぞらえて「パニング」と称している。)を行うことにより抗体を取得する技術が知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を単鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択する方法が知られている。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターに組み込み、ヒト抗体を容易に製造できるようになる(例えば、特許文献2、3)。



このように、抗体ライブラリを用いたパニングによる抗体医薬の候補となる抗体を取得する方法等が知られている。しかし、当該技術分野においては、抗原とファージとを結合する際には、抗原をポリスチレン製のチューブやプレートに固定することが通常であり、ブロッキングの操作が必要であることや、チューブ等に吸着したタンパク質が変性してしまうことがあった。その結果、ファージライブラリの中には、ブロッキングに用いたタンパク質や変性したタンパク質と結合するものが生じ、目的とする抗原以外の抗原に結合するファージが取得されてしまうという問題があった。



一方で、上記した抗体の取得方法とは逆に、多重膜リポソームを用いてペプチドライブラリから特定の抗体に結合するペプチドを取得する方法が開発されている(非特許文献1)。この文献では、モデルとして、多重膜リポソームに固定した抗オクタペプチド(FVNQHLCK、配列番号35)抗体に対して、ファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させたペプチドのライブラリを適用したところ、オクタペプチド(FVNQHLCK、配列番号35)が選択的に取得されることが確認されている。

産業上の利用分野


本発明は、単鎖抗体のスクリーニング方法及び単鎖抗体に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
多重膜リポソームに結合した抗原を準備する工程、
単鎖抗体を提示するファージライブラリを準備する工程、及び
前記ファージライブラリから、前記多重膜リポソームに結合した抗原に結合する単鎖抗体を提示するファージを選択する工程
を含む、抗原に結合する単鎖抗体のスクリーニング方法。

【請求項2】
前記単鎖抗体が前記抗原に対して1.5×10-2-1以下の解離速度定数を有する、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記単鎖抗体がウサギ由来である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
前記抗原がタンパク質である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】
前記タンパク質が抗体である、請求項4に記載の方法。

【請求項6】
前記抗体がヒト血清由来IgGポリクローナル抗体又はヒト血清由来IgAポリクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。

【請求項7】
前記単鎖抗体がヒト由来抗体のL鎖に結合する単鎖抗体である、請求項5又は6に記載の方法。

【請求項8】
前記タンパク質がエクソソーム由来タンパク質を含む、請求項4に記載の方法。

【請求項9】
前記タンパク質が、Sf9細胞株由来CD9のExtracellular Domain 2 (EC2)部分のみとヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。

【請求項10】
前記タンパク質がウイルス由来タンパク質である、請求項4に記載の方法。

【請求項11】
前記ウイルス由来タンパク質がインフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項10に記載の方法。

【請求項12】
前記インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項11に記載の方法。

【請求項13】
前記B型インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来Nucleotide-binding Protein である、請求項12に記載の方法。

【請求項14】
前記タンパク質が炎症性タンパク質である、請求項4に記載の方法。

【請求項15】
前記炎症性タンパク質がヒト由来炎症性タンパク質C-reactive Protein (CRP)である、請求項14に記載の方法。

【請求項16】
請求項1~15のいずれか1項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングする工程、
スクリーニングされた単鎖抗体のアミノ酸配列を決定する工程、
決定されたアミノ酸配列の可変領域の配列に基づき、抗体をコードするDNA配列を作成する工程、及び
作成されたDNA配列を宿主細胞で発現させる工程
を含む、抗体の製造方法。

【請求項17】
抗体をコードするDNA配列がヒト化抗体をコードする請求項16に記載の製造方法。

【請求項18】
ヒト血清由来IgGポリクローナル抗体に対して3.0×10-8M以下の解離定数を有する単鎖抗体。

【請求項19】
さらに、ヒト血清由来IgAポリクローナル抗体に結合する、請求項18に記載の単鎖抗体。

【請求項20】
ヒト血清由来IgAポリクローナル抗体に対して1.0×10-3-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。

【請求項21】
ヒト由来抗体のL鎖に対して1.0×10-3-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。

【請求項22】
エクソソーム由来タンパク質を含むタンパク質に対して8.0×10-3-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。

【請求項23】
前記タンパク質が、Sf9細胞株由来CD9のExtracellular Domain 2 (EC2)部分のみとヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質である、請求項22に記載の単鎖抗体。

【請求項24】
ウイルス由来タンパク質に対して1.0×10-2-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。

【請求項25】
前記ウイルス由来タンパク質がインフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項24に記載の単鎖抗体。

【請求項26】
前記インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項25に記載の鎖抗体。

【請求項27】
前記B型インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来Nucleotide-binding Proteinである、請求項26に記載の単鎖抗体。

【請求項28】
炎症性タンパク質に対して1.0×10-2-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。

【請求項29】
前記炎症性タンパク質がC-reactive Protein (CRP)である、請求項28に記載の単鎖抗体。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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