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(In Japanese)ターゲットの分析方法及びターゲット分析チップ

Patent code P190015809
File No. (S2016-0285-N0)
Posted date Jan 24, 2019
Application number P2017-562811
Date of filing Jan 16, 2017
International application number JP2017001280
International publication number WO2017126479
Date of international filing Jan 16, 2017
Date of international publication Jul 27, 2017
Priority data
  • P2016-011018 (Jan 22, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)村上 章
  • (In Japanese)小堀 哲生
  • (In Japanese)山吉 麻子
  • (In Japanese)野田 雄一郎
Applicant
  • (In Japanese)アークレイ株式会社
  • (In Japanese)国立大学法人京都工芸繊維大学
Title (In Japanese)ターゲットの分析方法及びターゲット分析チップ
Abstract (In Japanese)PCRを行うことなく、マイクロRNAをはじめとするターゲットを直接的に検出するための新たなターゲットの分析方法及びターゲット分析チップを提供する。
本発明のターゲットの分析方法は、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び担体に結合する担体結合用プローブとを接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第1の結合体を形成する工程、前記第1の結合体と前記担体とを接触させ、前記第1の結合体と前記担体とを結合反応させ、第2の結合体を形成する工程、前記担体を濃縮する工程、及び前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、血中マイクロRNA等のRNAと疾患との関連性が注目されており、前記RNAの検出を、疾患の早期発見等のため医療に利用することが試みられている。

マイクロRNAの定量方法としては、例えば、ターゲットのマイクロRNAをポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)により特異的に増幅して検出する方法が報告されている(特許文献1)。しかしながら、PCRが必須であるため、温度コントロールを行う装置、DNAへの逆転写等が必要であり、操作が煩雑となる。また、前記方法では、少量の試料に含まれるRNAから、逆転写によりDNAを得て、さらにPCRを行うことで増幅させている。しかし、このような逆転写PCRは、前記試料中のRNAの間接的な検出であって、直接的な検出ではないため、定量分析の場合、精度が十分ではないという問題がある。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ターゲットの分析方法及びターゲット分析チップに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第1の結合体を形成する工程である第1反応工程、
前記第1の結合体と前記担体とを接触させ、前記第1の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第2の結合体を形成する工程である第2反応工程、
前記第2の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第2の結合体を濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第2の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。

【請求項2】
 
前記担体結合用プローブが、第1結合物質を含み、
前記担体が、前記第1結合物質と結合する第2結合物質を含み、
前記担体結合用プローブが、前記第1結合物質と前記第2結合物質との結合を介して前記担体と結合する、請求項1記載のターゲットの分析方法。

【請求項3】
 
前記ターゲットが、ターゲット核酸である、請求項1又は2記載のターゲットの分析方法。

【請求項4】
 
前記ターゲット核酸が、マイクロRNAである、請求項3記載のターゲットの分析方法。

【請求項5】
 
前記標識プローブが、蛍光標識プローブである、請求項3又は4記載のターゲットの分析方法。

【請求項6】
 
前記蛍光標識プローブが、前記担体結合用プローブと比較して、前記ターゲット核酸の5’端側に結合する、請求項5記載のターゲットの分析方法。

【請求項7】
 
前記蛍光標識プローブが、前記ターゲット核酸の5’端から連続する塩基に結合し、
前記担体結合用プローブが、前記ターゲット核酸の3’端から連続する塩基に結合する、請求項6記載のターゲットの分析方法。

【請求項8】
 
前記蛍光標識プローブの蛍光標識が、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項5から7までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。

【請求項9】
 
前記蛍光標識が、ピレンを含む物質である、請求項8記載のターゲットの分析方法。

【請求項10】
 
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾され、
紫外線を照射することにより、前記ソラレンと前記ターゲット核酸とを結合させる工程を含む、請求項3から9までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。

【請求項11】
 
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有するターゲット分析チップを使用し、
前記反応部は、前記ターゲット、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記第2の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第2の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記第2の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C)を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動でき、
前記反応部に前記ターゲットを含む試料が導入された後、前記反応部にて前記第1反応工程が行われ、
さらに前記反応部にて前記第2反応工程が行われ、
前記反応部から前記流路を介して前記検出部までに至る間で前記濃縮工程が行われ、
前記検出部において、前記分析工程が行われる、請求項1から10までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。

【請求項12】
 
前記検出部の高さが、1~500μmである、請求項11記載のターゲットの分析方法。

【請求項13】
 
前記担体が、ビーズである、請求項1から12までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。

【請求項14】
 
前記ビーズの直径が、100nm~4μmである、請求項13記載のターゲットの分析方法。

【請求項15】
 
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、
前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第1の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第2の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第2の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第2の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力(R)より大きい遠心力(C)を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲットの分析チップ。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2017562811thum.jpg
State of application right Published
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