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病原性微生物検出のための方法及びキット NEW

国内特許コード P190015823
整理番号 AF19P023
掲載日 2019年1月24日
出願番号 特願2017-099579
公開番号 特開2018-038384
出願日 平成29年5月19日(2017.5.19)
公開日 平成30年3月15日(2018.3.15)
優先権データ
  • 特願2016-172515 (2016.9.5) JP
発明者
  • 野地 博行
  • 田端 和仁
出願人
  • 国立研究開発法人科学技術振興機構
発明の名称 病原性微生物検出のための方法及びキット NEW
発明の概要 【課題】インフルエンザウイルス等の病原性微生物を高感度に検出するために利用可能な技術の提供。
【解決手段】生物試料中の病原性微生物を検出する方法であって、前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、前記生物試料と、前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、を含む親水性溶媒を導入する導入手順と、前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつ前記病原性微生物と前記物質を包含する、親水性溶媒の液滴を形成する封入手順と、前記液滴中における前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物を光学的に検出する検出手順と、を含み、前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、病原性微生物検出方法を提供する。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要


近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易なインフルエンザウイルス検査キットが開発されている(特許文献1参照)。イムノクロマトグラフィを用いる方法は、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出できるので、感染の診断や治療等に活用されている。



また、従来、インフルエンザウイルスが有する酵素であるノイラミニダーゼと発色基質との反応に基づいて光学的にインフルエンザウイルスを検出する技術が知られている(特許文献2、3参照)。発色基質としては、例えば、4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid:4MU-NANA、特許文献2参照)や、4-アルコキシ-N-アセチルノイラミン酸又は4,7-ジアルコキシ-N-アセチルノイラミン酸の誘導体(特許文献3参照)などが用いられている。例えば、発色基質として4MU-NANAを用いた方法では、ノイラミニダーゼによる4MU-NANAの分解によって蛍光物質である4-メチルウンベリフェロンが生成する。生成した4-メチルウンベリフェロンの量に基づいてノイラミニダーゼの酵素活性値を算出することができ、さらに酵素活性値に基づいてインフルエンザウイルスの粒子数を定量することができる。



本発明に関連して、非特許文献1には、液滴がオイルで覆われており、外部から液滴に直接アクセス可能なフェムトリットルオーダーの液滴のアレイを用いて、一分子酵素アッセイを行う方法が記載されている。

産業上の利用分野


本発明は、病原性微生物検出のための方法及びキットに関する。より詳しくは、疎水性溶媒に被覆された親水性溶媒の極小容積中において、病原性微生物の表面又は内部の酵素による反応の結果生成する反応生成物を光学的に検出することによって病原性微生物の検出を行う方法等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出する方法であって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、前記生物試料と、前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、を含む親水性溶媒を導入する導入手順と、
前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつ前記病原性微生物と前記物質を包含する、親水性溶媒の液滴を形成する封入手順と、
前記液滴中における前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物を光学的に検出する検出手順と、を含み、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

【請求項2】
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記物質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項1記載の方法。

【請求項3】
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出するためのキットであって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、前記下層部における前記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えるアレイと、
前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、
前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する親水性溶媒と、
疎水性溶媒と、を含むキット。

【請求項4】
疎水性溶媒と界面接触する親水性溶媒中において、酵素と、該酵素による反応の基質となる物質とを反応させ、反応生成物を検出する方法であって、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

【請求項5】
前記親水性溶媒が病原性微生物を含み、
前記酵素が前記病原性微生物の表面又は内部に存在する基質切断活性を有する酵素であり、
前記物質が発色基質であり、
前記酵素による前記発色基質の切断により生成する反応生成物を光学的に検出する、請求項4記載の方法。

【請求項6】
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記発色基質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項5記載の方法。

【請求項7】
前記親水性溶媒が、前記病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を含む、請求項5又は6記載の方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2017099579thum.jpg
出願権利状態 公開
参考情報 (研究プロジェクト等) CREST プロセスインテグレーションによる機能発現ナノシステムの創製 領域
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