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METHOD AND KIT FOR PATHOGENIC MICROORGANISM DETECTION

Patent code P190015823
File No. AF19P023
Posted date Jan 24, 2019
Application number P2017-099579
Publication number P2018-038384A
Date of filing May 19, 2017
Date of publication of application Mar 15, 2018
Priority data
  • P2016-172515 (Sep 5, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)野地 博行
  • (In Japanese)田端 和仁
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title METHOD AND KIT FOR PATHOGENIC MICROORGANISM DETECTION
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technique that can be used to detect pathogenic microorganisms such as the influenza virus with high sensitivity.
SOLUTION: A method for detecting pathogenic microorganisms in a biological sample comprising: an introduction procedure in which a hydrophilic solvent including a biological sample and a substance to be used as a substrate which reacts with an enzyme found on the surface of or within the pathogenic microorganism is introduced into a space between a lower layer part formed by a plurality of storage parts for storing the pathogenic microorganism and an upper layer part facing the surface in which the storage part is formed in the lower layer part; an encapsulating procedure which forms drops of the hydrophilic solvent which includes the pathogenic microorganism and the aforementioned substance by introducing a hydrophobic solvent into the space and covering with the hydrophobic solvent in the storage part; and a detection procedure of optically detecting the reaction product formed by the reaction between the enzyme and the substance in the drop. The hydrophilic solvent has a pH value higher than the acid dissociation constant (pKa) of the reaction product.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易なインフルエンザウイルス検査キットが開発されている(特許文献1参照)。イムノクロマトグラフィを用いる方法は、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出できるので、感染の診断や治療等に活用されている。

また、従来、インフルエンザウイルスが有する酵素であるノイラミニダーゼと発色基質との反応に基づいて光学的にインフルエンザウイルスを検出する技術が知られている(特許文献2、3参照)。発色基質としては、例えば、4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid:4MU-NANA、特許文献2参照)や、4-アルコキシ-N-アセチルノイラミン酸又は4,7-ジアルコキシ-N-アセチルノイラミン酸の誘導体(特許文献3参照)などが用いられている。例えば、発色基質として4MU-NANAを用いた方法では、ノイラミニダーゼによる4MU-NANAの分解によって蛍光物質である4-メチルウンベリフェロンが生成する。生成した4-メチルウンベリフェロンの量に基づいてノイラミニダーゼの酵素活性値を算出することができ、さらに酵素活性値に基づいてインフルエンザウイルスの粒子数を定量することができる。

本発明に関連して、非特許文献1には、液滴がオイルで覆われており、外部から液滴に直接アクセス可能なフェムトリットルオーダーの液滴のアレイを用いて、一分子酵素アッセイを行う方法が記載されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、病原性微生物検出のための方法及びキットに関する。より詳しくは、疎水性溶媒に被覆された親水性溶媒の極小容積中において、病原性微生物の表面又は内部の酵素による反応の結果生成する反応生成物を光学的に検出することによって病原性微生物の検出を行う方法等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出する方法であって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、前記生物試料と、前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、を含む親水性溶媒を導入する導入手順と、
前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつ前記病原性微生物と前記物質を包含する、親水性溶媒の液滴を形成する封入手順と、
前記液滴中における前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物を光学的に検出する検出手順と、を含み、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

【請求項2】
 
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記物質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出するためのキットであって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、前記下層部における前記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えるアレイと、
前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、
前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する親水性溶媒と、
疎水性溶媒と、を含むキット。

【請求項4】
 
疎水性溶媒と界面接触する親水性溶媒中において、酵素と、該酵素による反応の基質となる物質とを反応させ、反応生成物を検出する方法であって、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

【請求項5】
 
前記親水性溶媒が病原性微生物を含み、
前記酵素が前記病原性微生物の表面又は内部に存在する基質切断活性を有する酵素であり、
前記物質が発色基質であり、
前記酵素による前記発色基質の切断により生成する反応生成物を光学的に検出する、請求項4記載の方法。

【請求項6】
 
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記発色基質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項5記載の方法。

【請求項7】
 
前記親水性溶媒が、前記病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を含む、請求項5又は6記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2017099579thum.jpg
State of application right Published
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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