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METHOD FOR DETERMINING WHETHER APTAMER CAN BE CREATED AND METHOD FOR CREATING APTAMER USING THE SAME

Patent code P190015839
File No. S2018-0744-N0
Posted date Feb 5, 2019
Application number P2018-121082
Publication number P2020-000051A
Date of filing Jun 26, 2018
Date of publication of application Jan 9, 2020
Inventor
  • (In Japanese)池袋 一典
  • (In Japanese)イ ジンヒ
  • (In Japanese)上野 絹子
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京農工大学
Title METHOD FOR DETERMINING WHETHER APTAMER CAN BE CREATED AND METHOD FOR CREATING APTAMER USING THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide methods for determining whether aptamers that bind to target proteins can be created by G4 PAS method.
SOLUTION: A method for determining whether an aptamer that binds to a desired target protein can be created by G4 PAS method comprises determining whether the target protein has a nuclear localization signal, or whether the target protein is a nuclear protein, and when a nuclear localization signal is present or when the protein is a nuclear protein, it is determined that the aptamer can be created by the G4 PAS method. The G4 PAS method comprises producing one or more aptamers having the same nucleotide sequence as one or more G4 structures in the promoter region of the gene encoding a target protein or in the promoter region of the gene of a transcriptional regulator that regulates transcription of the gene, and confirming that the produced aptamer binds to the target protein.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

アプタマーとは、特有の立体構造により特定の低分子や蛋白質などを認識し、結合する核酸リガンドを指す。従来、アプタマーはSystematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)によって創製されてきた。SELEX法ではポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う必要があるが、増幅の際にバイアスが生じることがあり、アプタマーの創製に失敗することがある。また、PCRを少なくとも数回は行う必要があるので、手間と時間がかかる。

一方、本願出願人は、標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター配列中にG-quadruplex構造(以下、「G4構造」と呼ぶ)が存在する場合、該G4構造を構成する塩基配列と同じ塩基配列を持つアプタマーが、標的蛋白質と結合することを見出し、この知見を利用して、SELEXを行わずにアプタマーを創製する方法(G4 promoter-derived aptamer selection (G4PAS)と命名)を提供し、特許出願した(特許文献1)。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、所望の標的蛋白質に結合するアプタマーの創製が、G4PAS法により可能か否かの判定方法及びこれを利用したアプタマーの創製方法並びに該創製方法を利用したアプタマーの製造方法に関する。さらに本発明は、前記創製方法により創製されたアプタマーに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
所望の標的蛋白質に結合するアプタマーが、G4PAS法により創製可能か否かの判定方法であって、前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否か、又は前記標的蛋白質が核内蛋白質であるか否かを調べることを含み、核移行シグナルが存在する場合又は核内蛋白質である場合に、G4PAS法により前記アプタマーを創製可能であると判定する方法であり、
ここで、G4PAS法は、標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合することを確認するステップと、
を含む方法である、前記判定方法。

【請求項2】
 
前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否かを調べることを含む、請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
所望の標的蛋白質に結合するアプタマーの創製方法であって、
前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否か又は前記標的蛋白質が核内蛋白質か否かを調べるステップと、
該標的蛋白質が核移行シグナルを有する場合又は核内蛋白質である場合に、
該標的蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域中又は該遺伝子の転写を調節する転写調節因子の遺伝子のプロモーター領域中の1又は複数のG4構造と同一の塩基配列を持つ1又は複数のアプタマーを作製するステップと、
作製したアプタマーが標的蛋白質と結合するか否かを確認するステップと、
を含む、標的蛋白質と結合するアプタマーの創製方法。

【請求項4】
 
前記標的蛋白質が核移行シグナルを有するか否かを調べるステップを含む、請求項3記載の方法。

【請求項5】
 
請求項3又は4記載の方法により創製されたアプタマー若しくは該アプタマーと95%以上の配列同一性を有する塩基配列を持ち、かつG4構造を含み、標的蛋白質と結合するアプタマー又はこれらのアプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ち標的蛋白質と結合するアプタマーを合成することを含む、アプタマーの製造方法。

【請求項6】
 
請求項3又は4記載の方法により創製されたアプタマーの塩基配列又は該塩基配列を含む塩基配列を持つアプタマーを合成することを含む請求項5記載の方法。

【請求項7】
 
配列番号84~91のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、PDGF-BBと結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちPDGF-BBと結合するアプタマー。

【請求項8】
 
配列番号163で示される塩基配列、若しくはこの塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、ApoE4と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちApoE4と結合するアプタマー。

【請求項9】
 
配列番号156~162のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、Annexin A2と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちAnnexin A2と結合するアプタマー。

【請求項10】
 
配列番号185、187、188、194、195、199、202、204のいずれかで示される塩基配列、若しくはこれらの各塩基配列との配列同一性が95%以上である塩基配列を持ち、かつ、G4構造を含み、SP1と結合するアプタマー、又は該アプタマーの塩基配列を含む塩基配列を持ちSP1と結合するアプタマー。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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