TOP > 国内特許検索 > プロテアーゼの切断性評価

プロテアーゼの切断性評価 UPDATE

国内特許コード P190015914
整理番号 S2017-0954-N0
掲載日 2019年3月22日
出願番号 特願2017-150361
公開番号 特開2019-024458
出願日 平成29年8月3日(2017.8.3)
公開日 平成31年2月21日(2019.2.21)
発明者
  • 本多 裕之
  • 加藤 竜司
  • 清水 一憲
出願人
  • 国立大学法人名古屋大学
発明の名称 プロテアーゼの切断性評価 UPDATE
発明の概要 【課題】高精度且つ迅速にプロテーゼの切断性を評価することを課題とする。
【解決手段】(1)標的タンパク質を構成するペプチドが、N末端からC末端に向かって1アミノ酸残基ずつC末端側にずれるように一定のアミノ酸残基数で且つ蛍光標識された状態でメンブレン上に固相化されたペプチドアレイを用意するステップ、(2)前記ペプチドアレイの各スポットの蛍光強度を測定するステップ、(3)前記ペプチドアレイに供試プロテアーゼを反応させるステップ、(4)酵素反応後の前記ペプチドアレイの各スポットの蛍光強度を測定するステップ、(5)各スポットの酵素反応前後の蛍光強度変化に基づき、酵素反応によって蛍光強度が低下したスポットを特定し、供試プロテアーゼによる切断性を評価するステップ、を行い、標的タンパク質に対するプロテアーゼの切断性を評価する。
【選択図】図1
従来技術、競合技術の概要

ペプチドとはアミノ酸が約2~50個つながってできたものである。食品として口から摂取したタンパク質は、体内の消化酵素によって分解されペプチドとなり、さらに分解されてアミノ酸となって、体内の組織や骨を形成する栄養素として吸収される。一方、栄養素となるのではなく、何らかの生理活性作用を持つペプチドが存在し、このようなペプチドを機能性ペプチドと呼ぶ。機能性ペプチドには血圧調整作用や抗菌作用を持つものが存在し、医薬品や食品、化粧品など幅広い分野で利用されている。

食品へ機能性ペプチドを利用する場合、例えば、食品タンパク質に酵素(プロテアーゼ)を作用させ特定の機能性ペプチドが作られる。そして、得られた機能性ペプチドを含んだ複数のペプチド断片を食品へ添加する形で利用している。この際、目的の機能性ペプチドを得るために、どのプロテアーゼを選択するべきかが大きな問題となる。最適なプロテアーゼを選択しなければ、目的のペプチドができないからである。従来技術として、プロテアーゼがタンパク質のどの部分を切断するかを同定する、LC-MSやMALDI-TOF MASを用いた検出法がある(例えば非特許文献1、非特許文献2を参照)。

産業上の利用分野

本発明はプロテアーゼ(タンパク質分解酵素)の切断性を評価する方法及びその応用に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下のステップ(1)~(5)を含む、標的タンパク質に対するプロテアーゼの切断性を評価する方法:
(1)標的タンパク質を構成するペプチドが、N末端からC末端に向かって1アミノ酸残基ずつC末端側にずれるように一定のアミノ酸残基数で且つ蛍光標識された状態でメンブレン上に固相化されたペプチドアレイを用意するステップ;
(2)前記ペプチドアレイの各スポットの蛍光強度を測定するステップ;
(3)前記ペプチドアレイに供試プロテアーゼを反応させるステップ;
(4)酵素反応後の前記ペプチドアレイの各スポットの蛍光強度を測定するステップ;
(5)各スポットの酵素反応前後の蛍光強度変化に基づき、供試プロテアーゼによる切断性を評価するステップ。

【請求項2】
ステップ(5)において、以下の計算式によって各スポットの切断率又はZスコアを算出し、算出結果を切断性の評価に用いる、請求項1に記載の評価方法。
【数1】
(省略)
【数2】
(省略)

【請求項3】
以下の規則に従って、n-x+1個のスポットが前記ペプチドアレイに形成されている、請求項1又は2に記載の評価方法:
前記標的タンパク質を構成するアミノ酸残基に、N末端からC末端に向かって昇順で1から番号を付け、第1スポットに1番目のアミノ酸残基~x番目のアミノ酸残基からなるペプチドを固相化し、第2スポットに2番目のアミノ酸残基~x+1番目のアミノ酸残基からなるペプチドを固相化し、・・・・第n-x番目のスポットにn-x番目~n-1番目のアミノ酸残基からなるペプチドを固相化し、第n-x+1番目のスポットにn-x+1番目~n番目のアミノ酸残基からなるペプチドを固相化する(但し、xは、各スポットに固相化するペプチドのアミノ酸残基数であり、2≦x≦10の条件を満たし、nは標的タンパク質のアミノ酸残基数である)。

【請求項4】
3≦x≦6である、請求項3に記載の評価方法。

【請求項5】
前記供試プロテアーゼとして二種類以上のプロテアーゼが併用される、請求項1~4のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項6】
前記標的タンパク質が食品タンパク質である、請求項1~5のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項7】
ステップ(4)において、各スポットの蛍光強度を経時的に測定し、各スポットの蛍光強度の経時変化に基づきステップ(5)の評価を行う、請求項1~6のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項8】
ステップ(3)の反応を二種類以上の条件で行い、
ステップ(4)では、各スポットの蛍光強度を条件毎に測定し、
ステップ(5)では、各スポットの酵素反応前後の蛍光強度変化を条件毎に特定し、供試プロテアーゼによる切断性を評価する、請求項1~7のいずれか一項に記載の評価方法。

【請求項9】
以下のステップを含む、標的タンパク質に対する酵素反応で生成するペプチドを推定する方法:
請求項1~8のいずれか一項に記載の評価方法で決定した切断箇所で前記標的タンパク質を切断して得られる断片ペプチドを、酵素反応で生成するペプチドであると推定するステップ。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

※ 画像をクリックすると拡大します。

JP2017150361thum.jpg
出願権利状態 公開
名古屋大学の公開特許情報を掲載しています。ご関心のある案件がございましたら、下記まで電子メールでご連絡ください。


PAGE TOP

close
close
close
close
close
close
close