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絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法 新技術説明会

国内特許コード P190015949
整理番号 FU-264
掲載日 2019年3月28日
出願番号 特願2016-105177
公開番号 特開2017-209063
出願日 平成28年5月26日(2016.5.26)
公開日 平成29年11月30日(2017.11.30)
発明者
  • 宮本 新吾
  • 秦 健一郎
出願人
  • 学校法人福岡大学
  • 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
発明の名称 絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法 新技術説明会
発明の概要 【課題】絨毛膜羊膜炎関連微生物の菌種を簡便に、定量的にかつ高精度に検出し、また、妊娠中に絨毛膜羊膜炎や起炎菌を高精度に検出する。
【解決手段】羊水などの被験試料中に含まれる細菌から抽出した全ゲノムDNAを、細菌共通の16SrRNA遺伝子のユニバーサルプライマーを利用して16SrRNA遺伝子を特異的にPCR増幅し、網羅的解析とOperational Taxonomic Unit解析(OTU解析)によって絨毛膜羊膜炎関連微生物を同定することとした。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要

早産は妊娠22週から37週未満に出産することをいう。早産は、感染と炎症が関与していることが多く(非特許文献1)、大半は腟からの上行性感染によって子宮内感染を来し、絨毛膜羊膜炎などの炎症反応を伴って発生すると考えられている(非特許文献2)。

このように、絨毛膜羊膜炎は、早産を引き起こす病態であり、早産の40%~70%、正期産の1%~13%に発症しているとみられ(非特許文献3)、早産や児の予後と強固に関連するが(非特許文献3)、絨毛膜羊膜炎を分娩前に有効に診断することは不可能である。

さらに、絨毛膜羊膜炎の発見治療が遅れれば、胎児感染をきたし、過剰な炎症に伴って種々の臓器障害を来す場合があり、児に重篤な障害を起こすことが問題視されている(非特許文献3-6)。

現在、絨毛膜羊膜炎の存在を予測する手法としては、1994年にLenckiらが提唱した基準(非特許文献7)が、日本産婦人科学会等が刊行する診療ガイドラインにも記載されている(非特許文献8)。しかし、この方法では、絨毛膜羊膜炎に対する感度が低いため早期発見が困難な症例が存在し、また起因菌が同定できず適切な治療ができないという大きな問題点がある。

また、子宮内感染は、妊娠週数が早いほど感染菌の検出率は高く(非特許文献9)、これまでの主な報告では(非特許文献10-13)、早産での検出率は、破水例では50%程度、さらに未破水例でも10%~22%と高く、羊水中で検出された菌種は属レベルで40種類に及ぶ多様な菌種が定性的に検出されている。

一部の施設で実施されている羊水検査でもその診断精度は低く(非特許文献1、2)、本発明者らが知る限りでは、従来法はいずれも定量的でかつ網羅的とはいえず、現在まで細菌検査で絨毛膜羊膜炎を高精度に予測しうる病原菌検査法を開発したという報告はない。

もし羊水中の絨毛膜羊膜炎起因細菌を定量的かつ網羅的に把握できれば、早産の予防・治療戦略を早期に選定でき、児の治療方針決定に有用と期待できる。

産業上の利用分野

本発明は、絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
羊水などの被験試料中に含まれる細菌から抽出した全ゲノムDNAを、細菌共通の16SrRNA遺伝子のユニバーサルプライマーを利用して16SrRNA遺伝子を特異的にPCR増幅し、UniFrac距離に基づく主座標分析とOperational Taxonomic Unit解析(OTU解析)によって絨毛膜羊膜炎関連微生物を同定することを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法。

【請求項2】
請求項1に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法であって、前記OTU解析によるOTUが16SrRNA遺伝子のユニバーサルプライマーの97%以上の類似度を有する菌種からなることを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法。

【請求項3】
請求項1または2に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法であって、前記絨毛膜羊膜炎関連微生物が、下記絨毛膜羊膜炎関連微生物の少なくとも1種から選ばれる菌種であることを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法。
ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)、
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、
ガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)、
ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、
スネシア・サンギネジェンス(Sneathia sanguinegens)、
カプノサイトファガ・スプチゲン(Capnocytophaga sputigene)、
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)ならびに
ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)。

【請求項4】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法にて同定された各菌種に特異的な下記フォワードプライマーとリバースプライマーからなる1対のプライマーから構成されるプライマーセットからなることを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット。
ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)のプライマーセット(プライマー名:U_p)(アンプリコンサイズ:652 bp);
フォワードプライマー:ATGTAGAAAGTCGCTCTTTGTG (22 mer)(SEQ ID NO:1)
リバースプライマー:GGCCGACATTTAATGATGATCG (22 mer)(SEQ ID NO:2);
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)のプライマーセット(プライマー名:M_p); (アンプリコンサイズ:543 bp);
フォワードプライマー:TTGGAATACCCATTGGAAACAA (22 mer) (SEQ ID NO:3) リバースプライマー:CTCTATCTAACTCTAGTTTGCT (22 mer)(SEQ ID NO:4);
ガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)のプライマーセット(プライマー名:G_p)(アンプリコンサイズ:464 bp);
フォワードプライマー:CTTGGAAACGGGTGGTAATGCT (22 mer)(SEQ ID NO:5) リバースプライマー:AGACGCGACGAACCGCCTACAA (22 mer) (SEQ ID NO:6);
ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)のプライマーセット(プライマー名:L_p)(アンプリコンサイズ:331 bp);
フォワードプライマー:TAATACCGGATAAAAGCTACTT (22 mer)(SEQ ID NO:7)
リバースプライマー:GTCAAATAAAGGCCAGTTACTA (22 mer)(SEQ ID NO:8);
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)のプライマーセット(プライマー名:H_p)(アンプリコンサイズ:662 bp);
フォワードプライマー:GCATTTCAGACTGGGTAACTA (21 mer)(SEQ ID NO:9)
リバースプライマー:TGAGATTCGCTCCACCTCGCA (21 mer)(SEQ ID NO:10);
スネシア・サンギネジェンス(Sneathia sanguinegens)のプライマーセット(プライマー名:Sn_p)(アンプリコンサイズ:308 bp);
フォワードプライマー:AGGGGACTGAGATACGGCCCTT (22 mer)(SEQ ID NO:11) リバースプライマー:GAGCCACAGGTTTTCACCTTC (21 mer)(SEQ ID NO:12);
カプノサイトファガ・スプチゲン(Capnocytophaga sputigene)のプライマーセット(プライマー名:C_p)(アンプリコンサイズ:441 bp);
フォワードプライマー:GAGCGGCATCGTTTTTATATT (20 mer)(SEQ ID NO:13)
リバースプライマー:AGGCAGTTGCTTAGTTGAGCTA (22 mer)(SEQ ID NO:14);
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)のプライマーセット(プライマー名:B_p)(アンプリコンサイズ:382 bp);
フォワードプライマー:TATCCAACCTGCCCTTTACTCG (22 mer)(SEQ ID NO:15)
リバースプライマー:AATACATACAAAACAGTATACA (22 mer)(SEQ ID NO:16);およびストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)のプライマーセット(プライマー名:St_p)(アンプリコンサイズ:275 bp);
フォワードプライマー:AGAAGTGACAGGTGGTGCATGG (22 mer)(SEQ ID NO:17)
リバースプライマー:AATCCGAACTGAGATTGGCTTTA (23 mer)(SEQ ID NO:18)。

【請求項5】
請求項4に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検査用プライマーセットを用いて羊水などの被験試料から請求項4に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物の下記菌種の少なくとも1種を検査することを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検査方法。
ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)、
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、
ガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)、
ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、
スネシア・サンギネジェンス(Sneathia sanguinegens)、
カプノサイトファガ・スプチゲン(Capnocytophaga sputigene)、
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)ならびに
ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)。

【請求項6】
請求項4に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用PCRプライマーセットを含むことを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用アッセイキット。

【請求項7】
請求項6に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用アッセイキットを用いて羊水などの被験試料から絨毛膜羊膜炎関連微生物を検出することを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出方法。

【請求項8】
請求項1ないし3のいずれか1項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物同定方法を用いて羊水などの被験試料中の絨毛膜羊膜炎関連微生物を同定することによって、または請求項4に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用PCRプライマーセットもしくは請求項6に記載のアッセイキットを用いて前記絨毛膜羊膜炎関連微生物の菌種を同定もしくは検出することによって絨毛膜羊膜炎を検出することを特徴とする絨毛膜羊膜炎検出方法。
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