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絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット、アッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法

国内特許コード P190015949
整理番号 FU-264
掲載日 2019年3月28日
出願番号 特願2016-105177
公開番号 特開2017-209063
登録番号 特許第6860771号
出願日 平成28年5月26日(2016.5.26)
公開日 平成29年11月30日(2017.11.30)
登録日 令和3年3月31日(2021.3.31)
発明者
  • 宮本 新吾
  • 秦 健一郎
出願人
  • 学校法人福岡大学
  • 国立研究開発法人国立成育医療研究センター
発明の名称 絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット、アッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法
発明の概要 【課題】絨毛膜羊膜炎関連微生物の菌種を簡便に、定量的にかつ高精度に検出し、また、妊娠中に絨毛膜羊膜炎や起炎菌を高精度に検出する。
【解決手段】羊水などの被験試料中に含まれる細菌から抽出した全ゲノムDNAを、細菌共通の16SrRNA遺伝子のユニバーサルプライマーを利用して16SrRNA遺伝子を特異的にPCR増幅し、網羅的解析とOperational Taxonomic Unit解析(OTU解析)によって絨毛膜羊膜炎関連微生物を同定することとした。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要

早産は妊娠22週から37週未満に出産することをいう。早産は、感染と炎症が関与していることが多く(非特許文献1)、大半は腟からの上行性感染によって子宮内感染を来し、絨毛膜羊膜炎などの炎症反応を伴って発生すると考えられている(非特許文献2)。

このように、絨毛膜羊膜炎は、早産を引き起こす病態であり、早産の40%~70%、正期産の1%~13%に発症しているとみられ(非特許文献3)、早産や児の予後と強固に関連するが(非特許文献3)、絨毛膜羊膜炎を分娩前に有効に診断することは不可能である。

さらに、絨毛膜羊膜炎の発見治療が遅れれば、胎児感染をきたし、過剰な炎症に伴って種々の臓器障害を来す場合があり、児に重篤な障害を起こすことが問題視されている(非特許文献3-6)。

現在、絨毛膜羊膜炎の存在を予測する手法としては、1994年にLenckiらが提唱した基準(非特許文献7)が、日本産婦人科学会等が刊行する診療ガイドラインにも記載されている(非特許文献8)。しかし、この方法では、絨毛膜羊膜炎に対する感度が低いため早期発見が困難な症例が存在し、また起因菌が同定できず適切な治療ができないという大きな問題点がある。

また、子宮内感染は、妊娠週数が早いほど感染菌の検出率は高く(非特許文献9)、これまでの主な報告では(非特許文献10-13)、早産での検出率は、破水例では50%程度、さらに未破水例でも10%~22%と高く、羊水中で検出された菌種は属レベルで40種類に及ぶ多様な菌種が定性的に検出されている。

一部の施設で実施されている羊水検査でもその診断精度は低く(非特許文献1、2)、本発明者らが知る限りでは、従来法はいずれも定量的でかつ網羅的とはいえず、現在まで細菌検査で絨毛膜羊膜炎を高精度に予測しうる病原菌検査法を開発したという報告はない。

もし羊水中の絨毛膜羊膜炎起因細菌を定量的かつ網羅的に把握できれば、早産の予防・治療戦略を早期に選定でき、児の治療方針決定に有用と期待できる。

産業上の利用分野

本発明は、絨毛膜羊膜炎関連微生物同定ならびに検出方法、絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセットならびにアッセイキット、および絨毛膜羊膜炎検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
フォワードプライマー:ATGTAGAAAGTCGCTCTTTGTG (22 mer)(SEQ ID NO:1)及びリバースプライマー:GGCCGACATTTAATGATGATCG (22 mer)(SEQ ID NO:2)で表されるウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:TTGGAATACCCATTGGAAACAA (22 mer) (SEQ ID NO:3)及びリバースプライマー:CTCTATCTAACTCTAGTTTGCT (22 mer)(SEQ ID NO:4)で表されるマイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:CTTGGAAACGGGTGGTAATGCT (22 mer)(SEQ ID NO:5)及びリバースプライマー:AGACGCGACGAACCGCCTACAA (22 mer) (SEQ ID NO:6)で表されるガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:TAATACCGGATAAAAGCTACTT (22 mer)(SEQ ID NO:7)及びリバースプライマー:GTCAAATAAAGGCCAGTTACTA (22 mer)(SEQ ID NO:8)で表されるラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:GCATTTCAGACTGGGTAACTA (21 mer)(SEQ ID NO:9)及びリバースプライマー:TGAGATTCGCTCCACCTCGCA (21 mer)(SEQ ID NO:10)で表されるヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:AGGGGACTGAGATACGGCCCTT (22 mer)(SEQ ID NO:11)及びリバースプライマー:GAGCCACAGGTTTTCACCTTC (21 mer)(SEQ ID NO:12)で表されるスネシア・サンギネジェンス(Sneathia sanguinegens)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:GAGCGGCATCGTTTTTATATT (20 mer)(SEQ ID NO:13)及びリバースプライマー:AGGCAGTTGCTTAGTTGAGCTA (22 mer)(SEQ ID NO:14)で表されるカプノサイトファガ・スプチゲン(Capnocytophaga sputigene)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:TATCCAACCTGCCCTTTACTCG (22 mer)(SEQ ID NO:15)及びリバースプライマー:AATACATACAAAACAGTATACA (22 mer)(SEQ ID NO:16)で表されるバクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)検出用の一対のプライマーと、
フォワードプライマー:AGAAGTGACAGGTGGTGCATGG (22 mer)(SEQ ID NO:17)及びリバースプライマー:AATCCGAACTGAGATTGGCTTTA (23 mer)(SEQ ID NO:18)で表されるストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)検出用の一対のプライマーと、
を備えることを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用プライマーセット。

【請求項2】
求項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検査用プライマーセットを用いて羊水の被験試料から請求項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物の下記菌種の少なくとも1種を検査することを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検査方法。
ウレアプラズマ・パルブム(Ureaplasma parvum)、
マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、
ガルドネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)、
ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、
ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、
スネシア・サンギネジェンス(Sneathia sanguinegens)、
カプノサイトファガ・スプチゲン(Capnocytophaga sputigene)、
バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)ならびに
ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)。

【請求項3】
求項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用PCRプライマーセットを含むことを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用アッセイキット。

【請求項4】
請求項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用アッセイキットを用いて羊水の被験試料から絨毛膜羊膜炎関連微生物を検出することを特徴とする絨毛膜羊膜炎関連微生物検出方法。

【請求項5】
求項に記載の絨毛膜羊膜炎関連微生物検出用PCRプライマーセットもしくは請求項に記載のアッセイキットを用いて前記絨毛膜羊膜炎関連微生物の菌種を同定もしくは検出することによって絨毛膜羊膜炎を検出することを特徴とする絨毛膜羊膜炎検出方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 登録
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