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糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法

国内特許コード P190016033
整理番号 (S2016-0753-N0)
掲載日 2019年5月9日
出願番号 特願2018-517094
出願日 平成29年5月12日(2017.5.12)
国際出願番号 JP2017018037
国際公開番号 WO2017195887
国際出願日 平成29年5月12日(2017.5.12)
国際公開日 平成29年11月16日(2017.11.16)
優先権データ
  • 特願2016-095997 (2016.5.12) JP
  • 特願2016-169200 (2016.8.31) JP
発明者
  • 太田 悠葵
  • 川崎 ナナ
  • 高倉 大輔
出願人
  • 公立大学法人横浜市立大学
発明の名称 糖鎖濃縮カラム及び糖鎖濃縮方法
発明の概要 微量の試料にも対応でき、短時間で糖ペプチドや遊離糖鎖を濃縮できる新規な糖鎖濃縮手段が開示されている。本発明による糖鎖濃縮カラムは、カラム内に、固相抽出担体層と、その上に直接又は間接的に積層されたポリマー性ポリオール層とを含む。固相抽出担体としてはオクタデシルシリル化シリカゲルなどを、ポリマー性ポリオールとしてはセルロース微結晶などを好ましく用いることができる。当該カラムは、N結合型糖鎖の濃縮、O結合型糖鎖の濃縮、遊離糖鎖の濃縮のいずれにも利用できる。
従来技術、競合技術の概要

質量分析を用いて糖ペプチドを分析する場合、糖ペプチドのイオン化部でのイオン化効率が低いため、糖タンパク質試料をトリプシン等の酵素で消化した消化物、すなわち、ペプチドと糖ペプチドの混合物から糖ペプチドを濃縮する必要がある。しかしながら、微量の試料にも対応でき、ごく短時間で糖ペプチドを濃縮できる手法はこれまでに知られていない。

例えば、糖ペプチド濃縮方法としては、疎水性物質を用いてペプチドを沈殿させることで糖ペプチドを濃縮する方法(特許文献1)、アガロースゲルを用いた親水性相互作用で糖ペプチドを濃縮する方法(非特許文献1)、アセトンを用いて糖ペプチドを沈殿させることで糖ペプチドを濃縮する方法(非特許文献2)が知られている。特許文献1は、糖ペプチドの濃縮の簡便化、迅速化に関する発明であるが、特許文献1記載の方法でも、糖ペプチドの濃縮には最低4時間から6時間を要する。また、特許文献1や非特許文献2のような沈殿形成を要する手法は微量の試料に対応しにくい。特許文献1はバッチ法による濃縮法であるが、バッチ法による濃縮も微量の試料に対応することが難しい。

産業上の利用分野

本発明は、糖鎖濃縮カラム、及び該カラムを用いた糖鎖の濃縮方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
カラム内に、固相抽出担体層と、その上に直接又は間接的に積層されたポリマー性ポリオール層とを含む、糖鎖濃縮カラム。

【請求項2】
固相抽出担体が少なくとも1種の逆相樹脂である、請求項1記載のカラム。

【請求項3】
固相抽出担体が、オクタデシルシリル化シリカゲル、多孔性固体炭素材料、並びにスチレンジビニルベンゼン、ジビニルベンゼン、N含有メタクリレート、及びN-ビニルピロリドンから選択される少なくとも1種の官能基を有するポリマーから選択される少なくとも1種である、請求項1又は2記載のカラム。

【請求項4】
固相抽出担体が、オクタデシルシリル化シリカゲル、多孔性固体炭素材料、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ジビニルベンゼンポリマー、N含有メタクリレートポリマー、及びポリ(N-ビニルピロリドン)から選択される少なくとも1種である、請求項3記載のカラム。

【請求項5】
ポリマー性ポリオールが多糖高分子である、請求項1~4のいずれか1項に記載のカラム。

【請求項6】
多糖高分子が、セルロース、アガロース、及びデキストランから選択される少なくとも1種である、請求項5記載のカラム。

【請求項7】
セルロースがセルロース微結晶又はセルロース繊維である、請求項6記載のカラム。

【請求項8】
固相抽出担体層とポリマー性ポリオール層の体積比が1:12.5~160である、請求項1~7のいずれか1項に記載のカラム。

【請求項9】
カラム容量が100μL~500μLである、請求項1~8のいずれか1項に記載のカラム。

【請求項10】
ポリマー性ポリオール層の体積が5~50μLである、請求項1~9のいずれか1項に記載のカラム。

【請求項11】
請求項1~10のいずれか1項に記載の糖鎖濃縮カラムに糖鎖含有試料及び試料溶解・希釈液を添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して、糖ペプチド又は遊離糖鎖をポリマー性ポリオール層に保持させる、試料添加工程;
カラム洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加してカラムを洗浄することにより、夾雑物を除去してポリマー性ポリオール層内に糖ペプチド又は遊離糖鎖を濃縮保持させる、選択的濃縮工程;及び
溶出液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して糖ペプチドを溶出する、溶出工程
を含む、糖ペプチド又は遊離糖鎖の濃縮方法であって、試料溶解・希釈液、カラム洗浄液、及び溶出液として含水極性有機溶媒を用いる、方法。

【請求項12】
糖ペプチドの濃縮方法であって、前記選択的濃縮工程に次いで、水性洗浄液をカラムに添加し、ポリマー性ポリオール層から固相抽出担体層に向かう方向の圧力をカラムに印加して、糖ペプチドを固相抽出担体層に濃縮する、再濃縮工程が行われる、請求項11記載の方法。

【請求項13】
含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が75%~95%である、請求項12記載の方法。

【請求項14】
遊離糖鎖の濃縮方法であって、試料溶解・希釈液及びカラム洗浄液として用いる含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が75%~95%であり、溶出液として用いる含水極性有機溶媒は、極性有機溶媒の濃度が40%~60%である、請求項11記載の方法。

【請求項15】
極性有機溶媒が、アセトニトリル及び低級アルコールから選択される少なくとも1種である、請求項11~14のいずれか1項に記載の方法。

【請求項16】
カラムへの圧力の印加が遠心により行われる、請求項11~15のいずれか1項に記載の方法。

【請求項17】
請求項1~10のいずれか1項に記載のカラムを含む、糖鎖濃縮キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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